醋蛋液的醒酒功效及其潜在醒酒功能因子研究

赵梦鸽，张 婞，武玉群，侯 焘,*

（1.农业农村部蛋品加工重点实验室，湖北武汉 430000；2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070）

目前，酒精所引发的健康风险已是一个不容忽视的问题。全球肝病病因学研究显示，超过1.5 亿人的肝病可归于饮酒[1]。长期或过量摄入酒精是诱发酒精性肝损伤的直接原因，同时，过量饮酒不仅会对中枢神经系统、心脏、消化道和生殖系统造成不良影响，还会导致营养失调和患癌率增高。酒精进入体内后90%在肝脏中代谢，其中有三个系统参与代谢：乙醇脱氢酶（ethanol dehydrogenase，ADH）系统、微粒体乙醇氧化系统以及过氧化氢酶系统[2]。ADH 催化绝大部分的乙醇生成乙醛和自由基，多数乙醛会经乙醛脱氢酶转化为乙酸[3]，最终转化为二氧化碳和水[4]。另一方面，乙醇的代谢会导致活性氧的产生，这些自由基不但促进细胞氧化和炎症因子释放，还能迅速与乙醇分子结合，形成活性代谢产物，使肝细胞表面脂质过度氧化，进而阻碍肝细胞代谢脂肪酸[5]，引发肝损伤。因此，开发具有促进酒精代谢的功能食品具有重要意义。

近年来，具有醒酒作用的天然活性物质日益受到关注。例如姜黄素、多糖、牛磺酸和小分子肽类等均被证明有醒酒的功效[6−8]。隋玉杰等[9−10]通过体外实验表明，经中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解得到的玉米肽都可激活ADH 活性，且中性蛋白酶水解得到的玉米肽对激活ADH 效果更好。随后，郭辉等[11]通过动物实验证实玉米肽在体内可以激活ADH 活性，促进乙醇代谢。马芝丽[12]详细研究了玉米五肽QLLPF 的醒酒活性，发现五肽QLLPF 对小鼠酒后体内乙醇的清除有显著的作用，当其剂量仅为混合肽剂量的1/20（10 mg/kg·bw）时，呈现更高的血醇清除率（35.00%）。

醋蛋液是我国的传统产品，具有原料来源广、受制因素少等优点。在醋蛋液的制作过程中，鸡蛋中的蛋白质、脂肪酸等在醋酸的水解作用下被降解，形成大量的低分子化合物和活性成分，如蛋白寡肽、溶菌酶、胆碱、卵磷脂、阿维丁、生物素、碳酸钙等，其不仅易于被人体吸收利用，同时还展现出了多种生物功能[13]。刘华桥等[14]通过测量饮酒后成年男性血压与血醇含量，发现醋蛋液具有一定的降低血压的功效以及醒酒活性。然而，目前针对醋蛋液醒酒作用的活性因子及其作用机理的研究尚未见文献报道。因此，本研究以醋蛋液为研究对象，利用小鼠醉酒模型，以苹果醋、酸奶、“海王金樽”为对照，考察醋蛋液醒酒作用的量效关系和时效关系，并利用nano-LC-MS/MS对经过体外模拟消化后的醋蛋液的结构进行分析鉴定，以期为醋蛋液发挥醒酒功效的关键因子提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康雄性昆明小鼠，体质量（20±2）g 购自三峡大学实验动物中心，实验动物许可证号为SCXK（鄂）2020-0018；“神丹1 号”醋蛋液 湖北神丹健康食品有限公司；“天地壹号苹果醋” 天地壹号饮料股份有限公司；风味发酵酸奶 光明乳业股份有限公司；“海王金樽”牡蛎大豆肽肉碱口服液 深圳市海王健康科技发展有限公司；乙醇脱氢酶（ADH）检测盒（20180709）、谷丙转氨酶（ALT）检测盒（20181227）、谷草转氨酶（AST）检测盒（20181227） 南京建成生物研究所；无水乙醇（分析级）、无水乙醇（色谱级）、正丁醇（色谱级）等生化试剂 国药集团化学试剂有限公司。

UV-102-02FW 紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；SP-7890 气相色谱仪 美国Agilent 公司；Orbitrap FUSION LUMOS 质谱仪 美国Thermo Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验及分组

1.2.1.1 不同剂量醋蛋液对酒后小鼠血清乙醇含量的影响 将体重为（20±2）g 昆明种雄性小鼠适应一周后随机分为6 组，每组8 只，分别为：空白组、模型组、醋蛋液0.5 瓶（27 mL/kg·bw）、醋蛋液1.0 瓶（54 mL/kg·bw）、醋蛋液1.5 瓶（81 mL/kg·bw）、醋蛋液2.0 瓶（108 mL/kg·bw）剂量组，实验前12 h 禁食不禁水。所有组（除空白组）灌胃53%的酒精溶液（10 mL/kg·bw），15 min 后，小鼠灌胃相应剂量的醋蛋液（模型组灌胃相应剂量的生理盐水），以灌胃酒精时间为基准，50 min 后处死小鼠，眼眶取血，收集全血样本。

1.2.1.2 醋蛋液的作用时间对酒后小鼠血清乙醇含量的影响 昆明种雄性小鼠64 只，适应一周后随机分为8 组，每组8 只，分别为：空白组、模型组、酒前30 min、酒前15 min、酒前5 min、酒后5 min、酒后15 min、酒后30 min，实验前12 h 禁食不禁水。模型组灌胃生理盐水（灌胃时间与醋蛋液组灌胃酒精时间一致），酒前给药组分别在灌胃54 mL/kg·bw 的醋蛋液（1.0 瓶）后30、15、5 min 灌胃53%酒精溶液（10 mL/kg·bw）；酒后给药组分别在灌胃53%酒精溶液（10 mL/kg·bw）后5、15、30 min 灌胃54 mL/kg·bw的醋蛋液（1.0 瓶）。以灌胃酒精时间为基准，50 min后处死小鼠，眼眶取血，收集全血样本。

1.2.1.3 醋蛋液与其他醒酒饮料醒酒效果 昆明种雄性小鼠48 只，适应一周后随机分为6 组，每组8 只，分别为空白组、模型组、醋蛋液（54 mL/kg·bw）、苹果醋（54 mL/kg·bw）、酸奶（54 mL/kg·bw）、海王金樽（54 mL/kg·bw）组，实验前12 h 禁食不禁水。所有组灌胃53%的酒精溶液，15 min 后，小鼠灌胃相应剂量的醋蛋液或市售样品（模型组灌胃相应剂量的生理盐水），以灌胃酒精时间为基准，50 min 后处死小鼠，眼眶取血，收集全血与肝脏样本。

1.2.2 气相色谱法测定小鼠血清中乙醇含量 仪器条件：气相色谱仪（SP-7890），TG-WAXMS 毛细管色谱柱：30.0 m×0.25 mm×0.25 μm，进样口温度150 ℃，FID 检测器，温度250 ℃，进样量1 μL，程序升温从40 ℃开始，以5 ℃/min 的速度增加到60 ℃，然后以20 ℃/min 的速度增加到120 ℃，并保留3 min。

方法：内标物为0.05%的正丁醇标准溶液。分别配制0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的乙醇（色谱级）标准溶液，将不同浓度的乙醇标准溶液与内标物以1:8 的体积比混匀，上机测定，以乙醇与正丁醇的峰面积比值对乙醇标准溶液的浓度作标准曲线。将上述小鼠全血在10000 r/min 的转速下低温（4 ℃）离心10 min，用移液枪定量移取血清至离心管中，并用封口膜封口后，置于−20 ℃冰箱冷冻保存，防止乙醇挥发。吸取50 μL 血清与0.05%正丁醇以1:8 的体积比混匀后上机测定，记录乙醇及正丁醇的峰面积，并通过标准曲线（拟合方程y=1.6355x+0.0042，相关系数=0.9988，计算样品中的乙醇浓度，此值即为所测得的血醇浓度[12]。

1.2.3 肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶活力 将1.2.1.3 所述小鼠处死后解剖取肝脏并用生理盐水漂洗，取适量肝脏，按重量（g）:体积（mL）=1:9 的比例，加入9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500 r/min，离心10 min，取上清液按照试剂盒说明直接测定肝脏中谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）活性。

1.2.4 血清乙醇脱氢酶活力 将1.2.1.3 所述小鼠血清中乙醇脱氢酶活性按照试剂盒说明直接进行测定。

1.2.5 醋蛋液醒酒肽的结构鉴定 取100 μg 醋蛋液（酶解蛋白总量根据项目要求调整）加入到1.5 mL 离心管中；按胰蛋白酶（μg）:底物蛋白（μg）=1:20 加入酶液，涡旋振荡后，低速离心1 min，37 ℃孵育4 h；取出消化好的肽段液进行除盐操作；将除盐后得到的肽段液冷冻抽干（<50 Pa，−37 ℃，12 h）。抽干的肽段样品用流动相A（2%乙腈，0.1%甲酸）复溶，20000×g 离心10 min 后，取上清进样。通过UltiMate 3000 UHPLC 进行分离。样品首先进入trap 柱富集并除盐，随后与自装C18柱（75 μm 内径，3 μm 柱料粒径，25 μm 柱长）串联，以300 mL/min 流速通过如下有效梯度进行分离：0～5 min，5%流动相B（98%乙腈，0.1%甲酸）；5～45 min，流动相B 从5%线性升至25%；45～50 min，流动相B 从25%升至35%；50～52 min，流动相B 从35%升至80%；52～54 min，80%流动相B；54～60 min，5%流动相B[15]。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

经过液相分离的肽段通过NanoESI 源离子化后进入到串联质谱仪Orbitrap Fusion Lumos 进行DDA（Data Dependent Acquisition）模式检测。其主要参数设置为：离子源电压设置为2 kV；一级质谱扫描范围350～1500 m/z；分辨率设置为60000；二级质谱起始m/z 固定为100；分辨率15000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到6+，峰强度超过20000的强度排在前30 的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap 中进行检测。动态排除时间设定为30 s。AGC 设置为：一级1E5，二级2E4。

1.3 数据处理

每个实验均重复三次，实验结果采用平均数±标准差的方式表示，应用统计分析软件SPSS25.0 进行单因素方差分析（one-way ANOVA），结果判定标准为：P<0.05 表示差异显著；P<0.01 表示差异极显著。图采用软件Graphpad Prism7.0 绘制。

2 结果与分析

2.1 不同剂量醋蛋液对酒后小鼠血清乙醇含量的影响

如表1 所示，灌胃27 mL/kg·bw 醋蛋液（0.5 瓶）具有一定的醒酒效果，但是其小鼠血醇浓度与乙醇模型组相比无显著性差异（P>0.05）；醋蛋液在灌胃剂量为54 mL/kg·bw 时（1.0 瓶），血醇清除率为16.97%；剂量为81 mL/kg·bw 时（1.5 瓶），其血醇清除率为13.78%；剂量为108 mL/kg·bw 时（2 瓶），血醇清除率为15.71%。在1.0 瓶剂量下，醋蛋液内的活性因子已经达到发挥醒酒效果的峰值，因此继续增加灌胃剂量没有得到更加强烈的效果。这与张自然[16]的研究保持一致，即牡蛎肉中醒酒活性成分并非含量越高，醒酒效果越好。并且醋蛋液的醒酒作用可能是由于醋蛋液能够在小鼠胃肠道内形成一层屏障，阻止酒精的体内吸收，而1.0 瓶的剂量足够形成保护屏障，增加灌胃剂量不会有进一步的增效效果。因此，后续实验将使用1.0 瓶醋蛋液为最优剂量，通过血醇浓度测定实验，探究不同作用时间的醋蛋液的醒酒效果。比较灌胃醋蛋液1.0 瓶、1.5 瓶、2.0 瓶组小鼠血醇浓度，可以发现三者之间醒酒效果没有显著性差异，因此从经济利益考虑，采用1.0 瓶醋蛋液为最佳灌胃剂量。

表1 醋蛋液灌胃剂量与血醇浓度Table 1 Intragastric dose of vinegar egg liquid and serum alcohol concentration

2.2 醋蛋液的作用时间对酒后小鼠血清乙醇含量的影响

由表2 所示，酒前30、15、5 min 灌胃醋蛋液后，其血醇清除率随灌胃时间的增加而增加，在灌胃乙醇前30 min 给予醋蛋液时，醒酒效果最佳，其血醇清除率达到20.70%，而酒前15 min 和5 min 醒酒效果不显著（P>0.05）。酒后5、15、30 min 灌胃醋蛋液后，其血醇清除率随灌胃时间的增加而增加，血醇清除率分别为20.04%、21.33%、23.94%，但这三组之间小鼠血醇浓度没有显著性差异（P>0.05）。酒前灌胃具有一定醒酒效果是因为醋蛋液在胃壁上形成一层保护屏障，阻止酒精的吸收。但是酒前灌胃醋蛋液的醒酒效果普遍次于酒后灌胃可能是因为只有机体摄入酒精后，醋蛋液才能够激活ADH，发挥醒酒效果。后续实验将使用血醇清除率最高的灌胃时间为最佳时间，即酒后15 min 和30 min，考虑到时间成本，最终选择酒后15 min 为最佳灌胃时间，通过血醇浓度测定实验比较醋蛋液与其他市售饮料或功能食品的醒酒效果。

表2 醋蛋液灌胃时间与血醇浓度Table 2 Intragastric administration time of vinegar egg liquid and serum alcohol concentration

2.3 醋蛋液与其他醒酒饮料对酒后小鼠血清乙醇含量的影响

由表3 数据可知，在摄入相同剂量的四种饮料时，醋蛋液具有最优异的醒酒效果。与模型组相比，灌胃醋蛋液与酸奶后，其小鼠血醇浓度显著下降（P<0.05），血醇清除率分别为20.82%和16.03%；灌胃苹果醋与“海王金樽”后，在血醇浓度数据上具有一定的醒酒效果，但是与乙醇模型组相比，没有显著性差异（P>0.05）。有研究发现，食用型果醋与酸奶均具有一定醒酒效果[17−18]，海王金樽牌牡蛎大豆肽肉碱口服液具有对化学性肝损伤有辅助保护作用、缓解体力疲劳的功能。以上结果表明醋蛋液具有良好的醒酒效果，且在同一剂量下优于苹果醋、酸奶、“海王金樽”。

表3 不同醒酒饮料与血醇浓度Table 3 Different sobering-up drinks and serum alcohol concentration

2.4 醋蛋液与其他醒酒饮料对酒后小鼠肝脏ALT、AST 活力的影响

血清谷丙转氨酶是一种肝细胞内丙酮酸和谷氨酸的转氨基酶，在肝细胞浆内生存，而谷草转氨酶则是在肝细胞浆的粒体中。如果肝细胞受到损伤，就会使血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平增高，因此，谷丙转氨酶水平、谷草转氨酶可作为检测肝功能损害的比较敏感指标[19−20]。如图1 所示，仅以“海王金樽”灌胃小鼠时，其肝脏中ALT 活力显著低于乙醇模型组（P<0.05）。如图2 所示，以酸奶与“海王金樽”灌胃小鼠时，其肝脏中AST 活力均显著低于乙醇模型组（P<0.05），灌胃醋蛋液与苹果醋后，小鼠肝脏中AST 活力与乙醇模型组相比无显著性差异（P>0.05）。“海王金樽”牡蛎提取物含有糖原、牛磺酸、甘氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、谷氨酸等各种氨基酸，可以分解体内的毒素并将其运输到体外从而起到保肝功能[21]。以上结果结合表3 中小鼠血清血醇清除率，表明醋蛋液、苹果醋、酸奶等均具有一定的醒酒效果，且醋蛋液醒酒效果最为优异；“海王金樽”具有良好的保肝作用，但是其醒酒效果远远低于醋蛋液等。

图1 各组醒酒饮料对酒后小鼠肝脏谷丙转氨酶活力的影响Fig.1 Effect of various sobriety drinks on the liver alanine transaminase activity of mice after alcoholic beverages

图2 各组醒酒饮料对酒后小鼠肝脏谷草转氨酶活力的影响Fig.2 Effect of various sobriety drinks on the liver aspartate aminotransferase activity of mice after alcoholic beverages

2.5 醋蛋液与其他醒酒饮料对酒后小鼠血清ADH 活力的影响

正常情况下，进入人体内的乙醇90%以上是在脱氢酶系统——乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的催化作用下完成代谢的，ADH 可以直接参与酒精的代谢，催化乙醇氧化为乙醛，产物乙醛又通过乙醛脱氢酶转变为乙酸，最终转化为二氧化碳和水[22]，ADH 活力水平是人体乙醇代谢的关键[23]。如图3 所示，与乙醇模型组比较，灌胃醋蛋液和苹果醋后，小鼠血清中ADH 活力显著升高（P<0.05），灌胃酸奶和“海王金樽”后，小鼠血清ADH 活力有所上升，但是均未达显著水平（P>0.05）。以上结果说明醋蛋液具有良好的醒酒功效，且与苹果醋的醒酒效果持平，并优于酸奶与“海王金樽”。

图3 各组醒酒饮料对酒后小鼠血清乙醇脱氢酶活力的影响Fig.3 Effect of various sobriety drinks on the serum ethanol dehydrogenase activity of mice after alcoholic beverages

2.6 醋蛋液醒酒肽的结构鉴定

醋蛋液总离子流图如图4 所示。蛋白质谱鉴定主要是通过实验串联质谱数据，与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配。利用UniProt、NCBI 和Ensembl 提供的在线质谱数据库进行比对，确定最终的肽段结构见表4。然后基于非标记定量蛋白质组学分析（intensity-based absolute-protein-quantification,iBAQ）算法，将每个蛋白组中总的峰面积除以理论能够观察到的肽段数目，从而获得最终的iBAQ 值。

图4 醋蛋液的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of vinegar egg liquid

表4 醋蛋液的结构解析结果Table 4 Peptides identified from vinegar egg liquid using nano-LC-MS/MS

利用nano-LC-MS/MS 对经过体外模拟消化后的醋蛋液进行了分析鉴定。通过与数据库比对，从醋蛋液中共发现69 条多肽序列与鸡蛋源高度吻合。鉴定出的肽段以8～12 肽为主，分子质量在700～3100 u 之间。研究表明，分子量小于5 ku 的玉米肽具有较强的血醇清除效果[24]，醋蛋液中的肽段分子量较小，这是其发挥醒酒作用的基础。从表4 可知，IDFLTK，ADTYFDNYRVG，ASLWIHNENQGFALAAPG， DASFIQNTYLHKLIG， EALQPIHDLADEAISR， FDAKIDVK， IVLMPVHTDADIDKIQLEIQAG，LPDMILYQKAVR，LPENAYLLK，LPENAYLLKVR， LPLEYGSYTTALAR， LPLSLPVGPR，LSSKLEISG，QQLTLVEVR，SHEIDMHPVNGQVK，VDSKCYSTEPVLR，YSKVIR 具有较高的iBAQ值，表明这些肽段在醋蛋液中具有较高的丰度。

此外，醋蛋液中含有大量的疏水性氨基酸，如苯丙氨酸（Phe，F）、亮氨酸（Leu，L）、异亮氨酸（Ile，I）和丙氨酸（Aal，A）。研究发现，L 和A 具有促进酒精代谢、清除自由基和防止脂质过氧化等活性[25]，69 条序列中仅有8 条序列完全不含有L 和A。同时，鉴定所得的多肽序列中含有丰富的抗氧化特征氨基酸，如L、F 和脯氨酸（Pro，P），53 条含有支链氨基酸L，29 条含有支链氨基酸F，41 条含有支链氨基酸P。值得注意的是，表4 所述序列中，16 条肽段的端基存在L，10 条肽段序列含有L-L（Leu-Leu）重复结构单元。

3 讨论与结论

数据分析显示，灌胃1.0 瓶、1.5 瓶、2.0 瓶醋蛋液组均具有一定的醒酒效果，其中以灌胃1.0 瓶醋蛋液醒酒效果最佳。酒前30 min 给醋蛋液醒酒效果优于酒前15 min 和5 min 给醋蛋液，酒后5、15、30 min灌胃醋蛋液，均具有优异的醒酒效果，且三种灌胃时间的平均血醇清除率相差不显著（P>0.05）。通过与市面上具有一定醒酒效果的饮料—苹果醋、酸奶、“海王金樽”相比，醋蛋液具有优于这三种饮料的醒酒效果。苹果醋虽然有一定的解酒效果，但因其富含二氧化碳会加速酒精在全身的扩散和渗透，导致酒精未被分解就被人体吸收，解酒效果不佳。酸奶中含有乳酸菌、乳酸、乳清酸等物质，促进人体肠道有益菌的增殖同时抑制有害菌的增殖，使机体对脂肪的吸收与利用增加，以降低心肌张力从而减小血管阻力促进新陈代谢起到醒酒效果[14]。醋蛋液中富含三羧酸循环中相关的含酶、辅酶及有机酸等使三羧酸循环和心血管血液循环顺畅，从而促进新陈代谢发挥醒酒功效[13]。乙醇脱氢酶系在乙醇代谢中起着十分重要的作用，其活性的高低决定了酒精在人体内的代谢速度[26]。实验结果表明，灌胃醋蛋液小鼠的血清乙醇脱氢酶活力高于对照组，而其肝脏中ALT、AST 活力显著高于“海王金樽”组（P<0.05）。

已有研究表明，玉米肽因其富含疏水性短肽，能够激活ADH3，促进乙醇代谢，从而起到解酒功效[8,11]。对醋蛋液成分进行结构鉴定，发现其结构序列中含有较多的疏水性氨基酸如L、F 和A 等。疏水性氨基酸的存在也有利于活性物质在体内发挥活性[27−28]，因为疏水性氨基酸可以改善肽段的脂溶性，使肽段更容易通过肠粘膜细胞的脂质屏障与脂肪酸自由基结合。此外，A 和L 还与三羧酸循环中的氧化型辅酶1 的产生密切相关，使三羧酸循环和心血管血液循环顺畅，从而促进新陈代谢，发挥醒酒功效[29]。鉴定所得的多肽序列中还含有丰富的具有抗氧化活性贡献的氨基酸，如L、F 和P，芳香族氨基酸如Phe 能够提供电子将自由基转化为稳定的分子从而发挥其抗氧化功能[30]；Pro 可抵抗乙醇的代谢产生的活性氧，从而抑制细胞氧化和炎症因子释放，使乙醇诱导的肝细胞表面脂质过度氧化减缓[31]；Leu 的疏水性侧链基团可以增加水-油界面肽的存在量，使其更易接近并清除脂相所产生的自由基，防止脂质过氧化[25]。更重要的是，从醋蛋液中鉴定的肽结构中发现了较多的LL 单元，此单元序列在醒酒玉米肽、源于朴树种子的抗氧化肽、降血压肽中也有发现，其存在显著影响醒酒活性的发挥[12]。

饮用醋蛋液可以促进血醇代谢，酒前饮用醋蛋液不仅具有解酒功效还可以保护胃黏膜不受损。醋蛋液能激活ADH，其醒酒效果可能与其有较多由疏水性氨基酸组成的多肽序列有关，且含有大量对醒酒有作用的结构单元，如Ala、Leu 及Leu 簇（Leu-Leu）等。建议在酒后15 min 以上时或酒前30 min 时，饮下1～2 瓶醋蛋液，以发挥其醒酒效果。