同位素稀释-高效液相色谱-高分辨质谱法测定乳及乳制品中3 种三嗪类农药

李 巧，戴 唯，王 缅，朱 明

（贵阳海关综合技术中心，贵州贵阳 550081）

三嗪类农药是一种广泛用于玉米、黄瓜等农作物生产的农药，在使用过程中可能对土壤、农作物、地表水和其他饮用水源造成污染，也可通过食物链在生物体内蓄积，影响人体内分泌系统的正常功能，甚至导致人类癌症或先天性缺陷[1−6]。本文研究的灭蝇胺、莠去津和异丙甲草胺其性质和作用各不相同：灭蝇胺（Cyromazine）是一种三嗪类昆虫生长调节剂，可诱导昆虫形态发生畸变[7]，在农作物生长过程中会降解代谢产生三聚氰胺等有害化学物质[8]；莠去津（Atrazine）又名阿特拉津，是一种成本低，使用广泛的三嗪类除草剂，其水溶性强、半衰期长，在水中不可降解, 对动物和水生生物的生殖发育存在毒害作用，对人体有潜在致癌、致畸、致突变的作用[9−11]；异丙甲草胺（Metolachlor）又名都尔，是一种活性高、用量少、选择性强、低毒除草剂，是我国获得登记使用的农药除草剂之一[12−13]。我国出口的食品中灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺均因残留问题被欧盟、美国、日本等国家发布预警通告，说明我国对这三种农药的把控不够严格，可能对我国食品的出口和人民的健康造成一定影响[14−19]。

自2008 年“三聚氰胺事件”发生以来，乳及乳制品的食品安全问题一直是社会研究的热点，引起广大人民及相关政府机构的重视[20]，针对乳及乳制品中农药残留限量，国家标准GB 2763-2019 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》 也做了相应的增加，但相对于发达国家和地区还有不足。如欧盟对乳及乳制品中灭蝇胺、异丙甲草胺限量值为10 μg/kg[21]，莠去津则采用“一律标准”10 μg/kg[22]；美国对乳及乳制品中灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺限量值分别为：50、20、20 μg/kg；日本对乳及乳制品中灭蝇胺、莠去津的限量值为10 、10 μg/kg，异丙甲草胺采用“一律标准”10 μg/kg[23]；而我国仅对生乳中灭蝇胺作出10 μg/kg 限量规定。目前，乳及乳制品中农药残留的检测方法有气相色谱-质谱法[24−25]、液相色谱-质谱法[26]、气相色谱法[27]、薄层分析法[28]等；其中灭蝇胺的检测方法有分子印迹液相色谱法[29]、液相色谱-质谱法[30]等，莠去津常用高效液相色谱串联质谱[30−32]、气相色谱法[33]等，异丙甲草胺多采用气相色谱-质谱法[34]等。对乳及乳制品的净化方式多使用凝胶渗透色谱（GPC）[13,30]，如李鹏等[30]研究的同位素稀释-高效液相色谱-线性离子阱质谱法测定总膳食乳类样品中8 种三嗪类农药,虽都使用同位素稀释-高分辨质谱，但净化方法复杂繁琐。因此本文选择灭蝇按、莠去津、异丙甲草胺为研究对象，C18固相萃取小柱净化，建立了乳及乳制品中3 种三嗪类农药的检测方法。

高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱质谱因其高选择性的四级杆和高分辨率、高灵敏度的轨道阱相结合，能够快速筛查目标物。它与三重四级杆低分辨质谱相比较，不用对目标物逐个离子及相关参数进行优化，通过提供母离子和碎片离子的精确质量数，从而准确推算可能的分子式[35−36]。同位素内标因其与对应化合物有相同的物理化学性质，当样品前处理和定量测定过程中有所损失时，相当量的内标物有补偿和校正作用，使得定量方法更为准确[37]。因此本文根据乳及乳制品的特点，以各目标化合物对应的同位素为内标，建立一种精准定性和准确定量的检测方法，为保障我国乳及乳制品的食品安全提供了有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奶粉、牛奶、酸奶 市售；莠去津 标准品，北京坛墨质检科技有限公司；灭蝇胺 上海安谱实验科技股份有限公司；异丙甲草胺 北京坛墨质检科技有限公司；莠去津同位素-D5、灭蝇胺同位素-13C3、异丙甲草胺同位素-D6 北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇 色谱纯，德国Merck 公司；氯化钠 农残级，山东西亚化学工业有限公司；无水硫酸钠 农残级，北京百灵威科技有限公司；甲酸 色谱纯，上海安谱科技有限公司；SPE C18（500 mg, 6 mL）固相萃取柱、SPE NH2（500 mg, 6 mL）固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司；SPE HLB （200 mg, 6 mL）固相萃取柱、ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 美国沃特世公司；Hypersil GOLD C18色谱柱 美国赛默飞世尔科技公司。

Dionex UltiMate 3000 高效液相色谱仪、高分辨质谱仪Q-Exactive ThermoFisher 公司；涡旋振荡器 Heidolph 公司；高速离心机 美国贝克曼公司；超声提取仪 Elmasonic 公司；Turbo Vap LV 氮吹仪 美国 Biotage 公司；ME802E电子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q 超纯水机 美国Millipore 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 准确吸取浓度为100 μg/mL 的灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺标准品各100 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混匀后得浓度为1.0 μg/mL 的中间混合液，置于4 ℃冰箱保存备用；准确吸取浓度为100 μg/mL 的灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺同位素内标各100 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混匀后得浓度为1.0 μg/mL 的同位素内标中间混和液，置于4 ℃冰箱保存备用。标准曲线的配制：分别吸取外标混标10、20、50、100、200、500 μL，同位素内标混标20 μL 于10 mL 容量瓶中，得到浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL,含同位素内标2.0 ng/mL 的标准曲线。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）, 流动相：0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）梯度洗脱条件：0～1.5 min,95%A, 1.5～7.0 min, 5%A, 7.0～8.5 min, 5%A, 8.5～8.51 min, 95%A, 8.51～10.0 min, 95%A, 整个分析流程共10 min。进样体积：10 μL，柱温35 ℃。

1.2.3 质谱条件 离子源：质谱采用加热HESI 源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full MS/dd-MS2；毛细管温度：325 ℃；喷雾电压：3000 V；吹扫气温度：350 ℃。一级质谱分辨率为70000，二级质谱分辨率为17500；归一化碰撞能量（NCE）为40、60 和80 eV，扫描范围：50～300 m/z。

1.2.4 样品前处理

1.2.4.1 样品提取 准确称取样品5 g（精确到0.01 g）于50 mL 聚丙烯离心管中，加入40 μL 浓度为1.0 μg/mL 内标中间液体，再加20 mL 乙腈，混匀后用30 ℃水浴超声提取10 min，依次加入1.0 g 氯化钠和5.0 g 无水硫酸钠，涡旋震荡5.0 min，10000 r/min 离心，待净化。

1.2.4.2 净化 用5 mL 甲醇，5 mL 水活化C18固相萃取柱，待液面到达筛板时，迅速取1 mL 提取液上柱，待液体浸出净化柱后，再取1 mL 提取液上柱，收集流出液过0.2 μm 滤膜上机测定。

1.3 数据处理

采用Xcalibur 软件进行数据的采集及处理；本文所用数据平行及重复次数、数据表示形式、统计学分析方法、显著性水平均采用“统计计算”及Excel软件。

2 结果与分析

2.1 质谱及色谱条件的确定

2.1.1 质谱条件的优化 三嗪类农药具有碱性氮原子，可以结合氢离子形成正离子，因此本试验在正离子模式下，采用Full MS/dd-MS2扫描模式，利用一级质谱全扫描以确定目标化合物的精确质量数（5 ppm）和保留时间，设定扫描范围（50～300 m/z），同时设定目标物列表，采用自动触发二级质谱模式，以获得3 种化合物的二级质谱图，确定其精确二级碎片离子。以一级母离子定量，一级母离子和精确二级质谱碎片离子定性，内标化合物提高定量和定性的准确度。浓度为100 ng/mL，3 种三嗪类农药色谱法及离子碎片图见图1；3 种三嗪类农药及其内标分子式、结构式、保留时间、母离子、离子碎片见表1。

表1 3 种三嗪类农药及其内标分子式、保留时间、母离子、离子碎片、结构式Table 1 Three kinds of triazine pesticides and their internal molecular formula, retention time, parent ion, ion fragment and structural formula

图1 3 种三嗪类农药的色谱峰及离子碎片图Fig.1 Chromatographic peaks and ion fragment profiles of three triazines

2.1.2 色谱条件的优化

2.1.2.1 流动相的优化 分别比较了甲醇、乙腈作为有机相，水、0.1%甲酸作为水相时的分离度和响应值，如图2 所示。当目标化合物浓度为50 ng/mL时，不同流动相对3 种三嗪类农药响应值的影响。其中目标物在0.1%（v/v）时甲酸体系中响应较高。可能是因为目标物在正离子模式下电离，而甲酸有利于目标物电离形成正离子，可以显著提高离子化效率[38]；有机相为甲醇时，化合物莠去津和灭蝇胺响应较高，虽然异丙甲草胺在乙腈体系的流动相中响应较高，但综合考虑到甲醇价格较便宜，且毒性较低，最终选择0.1%（v/v）甲酸-甲醇作为流动相。

图2 不同流动相对3 种三嗪类农药响应值的影响Fig.2 Effects of different types of the mobile phase on response values of three triazine pesticides

2.1.2.2 色谱柱的优化 灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺均属于极性化合物，ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱是极性分析首选柱，增强对极性分子的反相保留；Hypersil GOLD C18色谱柱对极性样品也具有良好的保留值和分离度。因此实验选择Hypersil GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）进行分析比较。实验结果表明，在Hypersil GOLD C18色谱柱和ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱上均得到优异的色谱峰形，保留时间分布均匀，重现性好，在Hypersil GOLD C18色谱柱上，灭蝇胺保留时间（0.9 min）相对靠后，综合考虑灭蝇胺和异丙甲草胺在Hypersil GOLD C18色谱柱上响应值较高（见图3），所以最终选择Hypersil GOLD C18色谱柱进行试验分析。

图3 不同色谱柱对3 种三嗪类农药响应值的影响Fig.3 Effect of different chromatographic columns on response values of three triazine pesticides

2.2 样品前处理条件的选择

2.2.1 提取条件的选择 目前乳及乳制品农药多残留分析中，提取溶剂大多采用乙腈、三氯乙酸和乙酸溶液[39−41]。本实验以奶粉为基质，分别考察了乙腈、1%三氯乙酸乙腈溶液和2%乙酸溶液的提取效果的差异，当提取溶剂为乙腈时，杂峰干扰较小，3 种三嗪农药回收率在74.8%～102%。三氯乙酸作为提取溶剂时，样品中灭蝇胺保留时间与标准溶液相比有较长延迟，可能是由于氯的吸电子诱导效应，羧酸上的电荷向氯的方向转移，降低了羧酸上氧的电荷密度，使氢离子更容易解离，酸性增强，因此不采用；用2%乙酸提取时，有轻微杂峰，且回收率为17.4%～59.0%，综合考虑选择乙腈作为提取试剂，详见图4～图6。

图4 不同提取剂对莠去津的影响Fig.4 Effects of different solvents on atrazine

图6 不同提取剂对异丙甲草胺的影响Fig.6 Effects of different solvents on metolachlor

2.2.2 样品净化条件的确定 结合文献[42−45]，本文选择C18固相萃取柱、NH2固相萃取柱和HLB 固相萃取柱对乳及乳制品进行净化，并比较分析。结果表明，C18柱效吸附样品中的杂质，净化效果良好，回收率为97.8%～103.0%，因此本实验采用C18柱作为净化柱。三种固相萃取柱对3 种三嗪类农药的影响见图7。

图7 不同净化柱对3 种三嗪类农药的影响Fig.7 Effects of different purification columns on three triazine pesticides

2.2.3 内标法和外标法定量差异比较 准确称取5.00 g 牛奶试样于50 mL 离心管中，分别加入100 μL浓度为1.0 μg/mL 的混合标准溶液和40 μL 浓度为1.0 μg/mL 的灭蝇胺-13C3、莠去津-D5、异丙甲草胺-D6 内标中间混合溶液；另取5.00 g 牛奶试样于50 mL 离心管中，只加入100 μL 浓度为1.0 μg/mL的混合标准溶液，两组试样按照1.2.4 节提取和净化步骤进行试验，结果为表2，由表2 可知，用内标法测试样品时，回收率更好，因此本实验采用内标法测定。

表2 内标法和外标法差异比较Table 2 Comparison between internal standard method and external standard method

图5 不同提取剂对灭蝇胺的影响Fig.5 Effects of different solvents on cyromazine

2.3 线性相关性、回收率、精密度、检出限

2.3.1 检出限 按照1.2.4 节的前处理方法对牛奶、奶粉及酸奶样品进行处理，向空白样品中添加不同水平浓度的目标化合物，以信噪比（S/N）≥3 对应的添加水平作为检出限（limit of detection, LOD），3 种三嗪类农药的检测限为5 μg/kg。

2.3.2 线性相关性、回收率、精密度 选取空白样品（牛奶、奶粉及酸奶）分别做3 个浓度的添加回收实验，每个添加水平做6 个平行样品，添加水平为5、10、25 μg/kg。结果表明3 种三嗪类农药的平均回收率为81.6%～104.0%，相对标准偏差为0.55%～4.14%。3 种三嗪类农药的线性回归方程、相关系数、回收率和相对标准偏差详见表3。

表3 3 种三嗪类农药的线性回归方程、相关系数、回收率和相对标准偏差（n=6）Table 3 Linear equations, correlation coefficients, standard recoveries and relative standard deviations of three triazine pesticides（n=6）

3 结论

采用乙腈提取，经C18固相萃取小柱净化，同位素内标法定量，建立了同位素稀释-高效液相色谱-高分辨质谱法测定乳及乳制品中3 种三嗪类农药的方法。方法前处理简单，灵敏度高，线性关系、回收率、精密度等均满足方法学指标，检出限为5 μg/kg，满足欧盟（灭蝇胺、异丙甲草胺及莠去津限量值为10 μg/kg）、日本（灭蝇胺、异丙甲草胺及莠去津限量值为10 μg/kg）、美国（灭蝇胺、莠去津、异丙甲草胺限量值分别为：50、20、20 μg/kg）等国家和地区的限量要求[21,46−47]，为保障我国乳及乳制品的食品安全提供了技术支撑，弥补了我国与发达国家因农残法规差异性带来检测项目的不足。