不同保鲜处理对鲜湿米线品质及腐败样品微生物多样性的影响

徐霞红，杨 莎，单长松，陈志刚

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

米线是亚洲地区的传统食品，以籼米为主要原料经挤压成型或切粉制得[1]。鲜湿米线由于食用便捷、口感爽滑而受消费者青睐。但鲜湿米线产品水分含量高，且制作过程极易被微生物污染，加之不适宜采用高压和长时间灭菌使其保质期较短[2]。因此如何有效控制微生物的安全风险、保证鲜湿米线的风味口感已经成为鲜湿米线行业亟待解决的问题。

鲜湿米线常见的保鲜手段有酸洗、添加防腐剂、热杀菌、微波杀菌等[3]。酸浸工艺是广泛使用的一种抑菌手段之一，有机酸浸泡通过改变鲜湿米线体系的pH，破坏了微生物生长的适宜环境，从而达到延长保质期的目的[4]。酸浸作为一种常见的保鲜技术在鲜湿米线中已经广泛应用，但是单一的酸浸并不能达到长期保鲜的效果，故需要结合其他保鲜技术联合使用。目前常用的化学防腐剂存在一定安全隐患[5]，而生物防腐剂具有更高的安全性而广受青睐[6]，其中ε-聚赖氨酸盐酸盐在人体内可分解为赖氨酸，然而其在鲜湿食品中的应用较少，需要做进一步研究。鲜湿米线热杀菌技术研究较多，但对最佳杀菌工艺无统一定论，一般认为水浴时间20～40 min，温度90～100 ℃为宜，且杀菌技术常联合其他保鲜技术一起使用具有更好的效果[7]。微波杀菌技术对米线保鲜有一定效果，但成本大不适应于工业化生产。

目前对鲜湿米线微生物菌群分析主要采用一代测序手段[8]，鲜见基于高通量测序分析菌群结构的报道。传统分离培养法步骤繁琐[9]，只有很少部分微生物可被培养，不能真正反映菌群多样性。高通量测序技术能同时检测出样本中的所有微生物[10]，为大量不可培养微生物的研究提供契机。

本文在酸浸的基础上探究生物保鲜剂与水浴杀菌对鲜湿米线贮藏过程中的蒸煮品质、感官品质、pH 及微生物数量的变化。对腐败样品基于Illumina Miseq 测序平台进行细菌16S rRNA V3-V4 区域及真菌rRNA ITS2 区域扩增子测序分析，更全面表现不同保鲜方式对菌群多样性和丰富度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

籼米 航埠粮油有限公司；柠檬酸 吉林中粮生化能源销售有限公司；ε-聚赖氨酸盐酸盐 浙江银象生物工程有限公司；CM101 平板计数琼脂、CM164 孟加拉红（虎红）培养基 北京路桥技术股份有限公司；HB0176-3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂培养基 海博生物技术有限公司；E.Z.N.A.® soil DNA kit Omega Bio-Tek 公司。

MX-5 小型全自动米线机 曲阜智造输送机有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅 上海中安医疗器械厂；P290 平面袋智能真空包装机 东莞市益广包装机有限公司；SW-CJ-1D 单人超净工作台 苏州净化设备有限公司；DHP120 生化培养箱南京生兴生物有限公司；J-2 菌落计数器 江苏天翎仪器有限公司；AB150pH 计 赛默飞世尔科技公司；ABI GeneAmp® 9700PCR 仪 美国ABI 公司；Illumina Miseq PE300 测序平台 美国Illumina 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜湿米线制作工艺流程及样品制备

样品制备：

a. 对照组（CK）：用蒸馏水浸泡2 min，沥干水分后包装。

b. 酸浸处理组（CA）：根据预实验结果选择浓度为1%柠檬酸浸泡2 min，此条件下对鲜湿米线感官影响不明显，产品无明显酸味。

c. 酸浸结合ε-聚赖氨酸盐酸盐处理组（PL）：ε-聚赖氨酸盐酸盐添加量根据食品添加剂国标GB2760-2014 中大米及其制品规定的限量（上限0.25 g/kg）为基础确定添加0.2 g/kg。制备时将其溶于蒸馏水中，混入原料籼米中搅拌均匀。

d. 酸浸结合水浴杀菌处理组（SY）：当水浴杀菌时间大于20 min 米线表面变软，出现黏条现象，故确定水浴时间为20 min，水浴结束后迅速在冰水浴中冷却5 min。

所有样品用高温蒸煮袋包装，100 g/包，在25 ℃恒温培养箱中贮藏，无需避光处理。

1.2.2 蒸煮品质

1.2.2.1 蒸煮损失的测定 参照文献并有所改动[11]，称取5 g 左右鲜湿米线（M1），预测得水分含量为W，在50 mL 沸水中保持微沸蒸煮5 min，捞出米线后继续加热蒸干大部分水分，取余下米汤于已知质量为M2的铝盒中。在105 ℃下，烘至恒重，记为M3。

1.2.2.2 断条率的测定 参照郭静璇等[12]的方法，取20 cm 左右长度均匀的米线30 根，加入500 mL沸腾的蒸馏水保持微沸，煮5 min 后挑出记录断条数n（n 为总条数-煮后完整条数）。

1.2.3 感官评分 参考周显青等[13]的方法并有所改动，综合米线煮前气味、外观和煮后质地、滋味等指标综合评判鲜湿米线的感官，以10 分为满分，低于5 分为不合格，由经过统一培训的感官评定小组进行打分，感官评价标准见表1。

表1 鲜湿米线感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of wet rice noodles

1.2.4 pH 测定 参照Aregbe 等[14]的方法，称取样品10 g，与90 mL 去离子水研磨成匀浆，使用pH 计测定样品在储藏过程中的变化。

1.2.5 微生物指标测定 菌落总数测定方法：GB4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》;霉菌、酵母测定测定方法：GB 4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》；大肠菌群测定方法：GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数》。

1.2.6 扩增子测序分析 当不同配方腐败后的鲜湿米线可培养微生物达到5 lg CFU/g 左右，将样品经液氮冷冻磨碎后，采用基因组DNA 提取试剂盒对鲜湿米线微生物进行基因组DNA 提取，并进行PCR 扩增，细菌采用16S rRNA 基因V3-V4 区合成引物，338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）进行PCR 扩增。真菌采用ITS rRNA 基因ITS2 区合成引物，ITS3F（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。PCR 产物目的条带大小正确，浓度合适后使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit 进行建库，利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台测序。使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行拼接，操作分类单元（OTUs）用UPARSE（ Version7.1， http://drive5.com/uparse） 聚类， 用UCHIME 识别和去除嵌合序列。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，分别比对Silva（细菌）和Unite（真菌）数据库，设置比对阈值为70%。

1.3 数据处理

用IBM SPSS Statistics 22 软件进行数据处理与分析，计算平均值及标准偏差，并进行单因素方差分析，以邓肯（Duncan）多重比较法进行显著性分析（P<0.05）。用Origin 2018 软件作图。所有生物信息学分析均基于Majorbio I-Sanger Cloud（www.majorbio.com）在线平台进行。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间蒸煮品质的变化

由于目前对于鲜湿米线的蒸煮品质没有统一的国标，故参照湖南省地方标准（DB43/156-2007），认为当蒸煮损失≥2.0%，断条率≥15%时，为鲜湿米线蒸煮品质的保质期终点。由图1 可知，对照（CK）样品的蒸煮损失和断条率均在第3 d 超过可接收值，分别为2.11%±0.11%和21.67%±0.71%。这可能是由于某些微生物的代谢产物能分解淀粉，使挤压米线的淀粉凝胶结构受到破坏，导致蒸煮损失增加，断条率变高，米线失去弹性和筋道感。而经过不同保鲜处理的米线品质劣变都得到延缓。其中酸浸结合水浴杀菌（SY）的米线，蒸煮损失和断条率分别在第17 d 和第15 d 达到2.08%±0.13%和18.33%±0.71%，超过可接收值。储藏期间蒸煮损失和断条率不断缓慢上升，可能是米线中的淀粉体系长期老化所致[15]，而当贮藏第13 d 微生物开始迅速生长后米线蒸煮品质有较大的下降。

图1 鲜湿米线贮藏过程中蒸煮损失（A）及断条率（B）变化趋势Fig.1 Cooking loss（A）and broken rate（B）trend of wet rice noodles during storage

2.2 贮藏期间感官品质的变化

刚制备的鲜湿米线（图2A-1 和图2A-2）外观呈米白色且色泽均一，具有米香味，入口爽滑，韧性好，四组样品具有相似的感官。图2 B1～B4 为腐败变质后的米线，当贮藏第3 d 可以明显观察到CK 组出现发黏现象，并伴有明显刺激性气味，感官评分低于可接受分值（5 分）。这种刺激性气味可能是由于部分微生物发酵淀粉产生酒味[16−17]。产品变黏可能与第3 d 突然增多的大肠菌群有关（见表2）[18]。CA 组、PL 组和SY 组分别在第4、6 d 和17 d 表面出现少量霉斑，且伴随有霉味，低于感官可接受分值。值得注意的是，保鲜处理后的样品并未出现发黏现象。

表2 鲜湿米线贮藏期间微生物生长变化趋势Table 2 Change trend of microbial population of wet rice noodles during storage

图2 新鲜制备的米线（A）、腐败米线（B）的外观比较和贮藏过程中米线的感官评分变化（C）Fig.2 Comparison of appearance of freshly prepared rice noodles（A）and spoiled rice noodles（B）and sensory changes（C）of wet rice noodles during storage

2.3 贮藏期间pH 的变化

鲜湿米线在贮藏期间的pH 变化如图3 所示，对照组样品的初始pH 为5.62±0.06，经过酸浸处理初始pH 为4.51±0.08，低于对照组。CK 组、CA 组及PL 组样品的pH 随着微生物的生长而降低，相比之下，CK 组的下降幅度较处理组更明显，当贮藏3 d 后下降了0.47。pH 降低的主要原因可能是微生物利用样品中的营养物质发酵产酸[19]，而保鲜处理后的样品微生物生长受到抑制，使其发酵产酸减少，pH 变化较小。SY 组在较长时间内保持稳定的pH，当贮藏11 d 时pH 有略微的上升，在此时该样品组微生物开始生长，当贮藏13 d 之后微生物大量生长时pH 由于微生物代谢产酸而再次下降，在贮藏17 d 后，从第13 d 的4.61±0.01 下降到4.22±0.09。

图3 鲜湿米线在贮藏过程中的pH 变化Fig.3 Changes in pH of wet rice noodles during storage

2.4 贮藏期间微生物生长的变化

参考广西（DBS 45/050-2018）、云南（DBS 53/017-2014）等地方标准[20]，认为当菌落总数超过5 lg CFU/g 或霉菌总数超过2.2 lg CFU/g 或大肠菌群超过1.4 lg CFU/g 时为微生物指标的最大限值。由表2 可知当贮藏2 d 时CK 组样品霉菌和细菌总数都已经超过或接近标准。CA 组、PL 组均能短时间抑制微生物的生长，分别在第3 d 和第5 d 达到微生物上限。SY 组使鲜湿米线的微生物在15 d 内不超标，但在贮藏11 d 后逐渐检测出酵母及细菌生长，在第17 d 霉菌（3.58±0.06 lg CFU/g）和大肠菌群（3.52±0.04 lg CFU/g）都超过最大限值。

2.5 腐败米线样品中细菌和真菌多样性分析

为保证菌落丰度达到测序要求，将可培养微生物达到5 lg CFU/g 左右且感官不可接受的样品进行高通量测序，分别对CK 组、CA 组、PL 组和SY 组贮藏第3 d、第4 d、第6 d 和第17 d 的样品进行测序。

2.5.1 鲜湿米线中微生物Alpha 多样性分析 由表3得所有样本的Coverage 指数均大于0.99，说明测序结果覆盖较多且可信。SY 组ACE 指数和Chao1指数较其他组小，细菌ACE 指数为31.40、Chao1 指数为30.25，真菌ACE 指数为13.00，Chao1 指数为10.50，说明SY 组的物种丰富度较低[21]。这是由于水浴处理后耐热性差的微生物被杀死或生长受到抑制，使物种丰富度明显减少。CK 组样品细菌Shannon指数较大，Simpson 指数较小，分别为2.18 和0.17，真菌Shannon 指数较小，Simpson 指数较大，分别为0.27 和0.88。表明在未做任何抑菌处理时细菌菌落丰度及多样性水平相对较高，而真菌多样性水平较低[22]，说明细菌在淀粉基质上的生长力强于真菌[18]。

表3 鲜湿米线腐败样品α 多样性Table 3 The Alpha diversity indices of spoiled wet rice noodles

2.5.2 不同分类水平上细菌及真菌物种组成分析

2.5.2.1 基于门水平的腐败样品菌群结构分析 由细菌在门水平上的样本群落组成结构（图4A）可知，变形菌门（Proteobacteria）为所有样品的主要优势菌，其中厚壁菌门（Firmicutes）在CK 组和SY 组都具有较高的相对丰度，当酸浸处理后厚壁菌门减少到0.81%，PL 组其相对丰度减少到0.51%。但SY 组长期贮藏后厚壁菌门占比提高到40.84%，这可能是因为厚壁菌门在极端环境下能生成芽孢或分生孢子，等环境适宜后再生长，所以在CK 组和SY 组样中都有较大占比[23]。

图4 细菌（A）和真菌（B）相对丰度分布（门水平）Fig.4 Abundance distribution of bacteria（A）and fungi（B）（phylum level）

由真菌的群落组成结构图（图4B）可知，毛霉门（Mucoromycota）是对照样品的优势菌门，占比93.83%，经过酸浸处理后毛霉门减少，说明酸浸可以明显抑制毛霉门的生长，PL 组和SY 组该菌门所占比例减少至0.1%以下。对于保鲜处理组，子囊菌门（Ascomycota）成为优势菌门，在CA 组、PL 组和SY 组分别占比53.04%、99.98%和99.73%。这可能是由于子囊菌门在酸处理、热处理等逆境中能形成孢子，当环境适宜再大量繁殖，所以在抑菌处理后其占比明显上升，成为优势菌门[24]。

2.5.2.2 基于属水平的腐败样品菌群结构分析 由细菌属水平上的群落组成结构图（图5A）可知对照样品中细菌群落分布较为均匀，泛菌（Pantoea）所占比例最大为30.79%，其次为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas），占比为26.30%，芽孢杆菌（Bacillus）的占比为21.96%。这一结果与黄永平等[25]、陈志渝[8]通过传统培养法研究鲜湿米线优势腐败菌为肠杆菌科和芽孢杆菌的结果一致。泛菌和芽孢杆菌是常见的水稻内生菌，主要来源于原料籼米中[26−27]。鞘氨醇单胞菌广泛分布于水体、土壤、空气中，是一种耐受贫养微生物[28−29]。酸浸处理组样品中，适宜在中性环境生长的鞘氨醇单胞菌的相对丰度下降至0.01%以下[30]，使肠杆菌科的未分类肠杆菌（unclassified_f_Enterobacteriaceae，24.49%）、泛菌（21.77%）相对丰度上升，成为主要优势菌。ε-聚赖氨酸盐酸盐对芽孢杆菌、肠杆菌都有抑制作用，所以PL 组其相对丰度都明显下降。SY 组的主要优势菌为肠杆菌科和芽孢杆菌。这可能是由于肠杆菌科虽然耐热性较低，但水浴杀菌只能损坏其细胞表面，使其生长受到抑制，却不能完全将其杀灭[31]。而芽孢杆菌耐受能力强[23]，在逆境中可形成芽孢防止危害，后期适应环境后迅速繁殖[32]。

图5 细菌（A）和真菌（B）相对丰度分布（属水平）Fig.5 Abundance distribution of bacteria（A）and fungi（B）（genus level）

根霉菌属（Rhizopus）、枝孢菌属（Cladosporium）、链孢霉属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）等都是在米制品中的常见真菌属[33]。由真菌属水平群落组成结构图（图5B）可知根霉菌属（Rhizopus，93.83%）是对照样品的优势菌属，根霉菌具有较强致腐能力，可产生水解酶分解淀粉产生乙醇，缩短样品保质期[34]。当保鲜处理后根霉菌属相对丰度显著降低，样品保质期延长。酸浸样品中能适应广泛pH 范围（pH3～9）的链孢霉（Neurospora，34.91%）相对丰度明显提升。PL 组根霉属和链孢霉属相对丰度降低为0.01%以下，青霉（Penicillium，47.8%）成为主要优势菌属。由于各菌属耐热能力不同，水浴处理后菌群结构发生较大变化[35]，耐热性较强的枝孢霉菌（Cladosporium）成为优势菌[24]。

2.5.3 主成分分析（PCA） 基于欧氏距离（非加权）算法在OTU 水平进行主成分分析。细菌（图6A）和真菌（图6B）前两个主成分的贡献率分别为88.46%和89.52%，说明这两个主成分可以反映出不同处理样品微生物差异的大部分信息。通过PCA 分析发现，四组不同处理的样品微生物组成差异明显，由图6A 可知在PC1 上PL 组和其他样品相距较远，说明在这一主成分水平该样品与其他样品细菌群落特征差异较大。由图6B 可知在PC1 上CK 组的真菌群落结构组成与其他样品距离较远，说明经过不同保鲜处理在PC1 上对真菌群落特征有较大影响。在PC2 上SY 组与其他样品相距较远，说明在这一主成分水平热处理对真菌群落有较大影响。

图6 细菌（A）和真菌（B）主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacteria（A）and fungi（B）

3 结论

本文研究了鲜湿米线在25 ℃贮藏条件下品质变化和微生物生长的情况及其关联性。实验结果表明，SY 组在较长贮藏时间内品质指标及pH 下降都较缓慢，提高了产品的贮藏稳定性并延长货架期至13 d。CA 组、PL 组保质期分别延长为2 d 和4 d，且相比对照组样品具有较低的蒸煮损失和断条率，pH 降低较对照样品少。经过保鲜处理后的样品腐败后不再出现发粘现象，而是表面产生霉斑。

通过对腐败样品的微生物多样性分析可得：所有样品的优势细菌门为变形菌门，其次为厚壁菌门。CK 组厚壁菌门相对丰度较高，CA 组及PL 组明显减少了厚壁菌门的相对丰度。CK 组的优势腐败细菌为泛菌、鞘氨醇单胞菌和芽孢杆菌。CA 组明显降低了鞘氨醇单胞和芽孢杆菌属的相对丰度。ε-聚赖氨酸盐酸盐对各优势菌属都具有较强的抑制作用，伯克氏菌（Burkholderiales）成为PL 组的优势菌属。对照组的优势腐败霉菌门为毛霉门，优势腐败菌属为根霉菌属，在保鲜处理后其相对丰度明显降低（<0.1%）。而抗逆境能力较强的子囊菌门成为保鲜处理后样品的主要优势腐败真菌。

综上所述，本文所运用的保鲜技术（尤其是酸浸结合水浴处理）可以有效抑制微生物生长，降低产酸和致腐能力较强微生物的相对丰度，从而延缓食用品质和pH 下降，达到延长货架期的目的。本研究结果为鲜湿米线保鲜及其工业化生产提供了理论基础。