基于代谢组学分析工夫红茶发酵过程中代谢物的变化

宫连瑾，薄佳慧，杜哲儒，李 瑾，孙红玉，陈义琴，裴若云，肖力争,3,*

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128；2.湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3.湖南农业大学植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南长沙 410128）

工夫红茶是我国特有的传统茶类，具有滋味甘甜醇厚、香气优雅高长、汤色明亮的典型特征[1]。工夫红茶的初制过程为萎凋、揉捻、发酵（氧化）和干燥，其中发酵过程是其色、香、味形成的关键工序[2]。因此，探索工夫红茶发酵过程中内含物质的变化，是了解工夫红茶品质形成的重要途径。然而，由于分析方法的限制，对于复杂的发酵过程往往不能进行全面的研究。

如今，随着科学技术的发展，检测茶叶各方面指标的方法也开始增多，其中代谢组学技术已被广泛应用于茶叶研究[3]。代谢组学研究主要采用气相色谱质谱联用、高效液相色谱质谱联用、核磁共振、毛细血管电泳技术等方法，阐明茶叶加工过程中的化学变化，更加全面的展现了茶叶从种植到加工过程中内含物质的动态变化规律，从而揭示茶叶特殊风味的形成原理[4−6]。例如，研究证明，运用GC-MS（气相色谱质谱联用）可分离和鉴定红茶中微量和芳香活性成分[7]。郑起帆等[8]通过研究不同山头普洱生茶的差异代谢物，运用1H-NMR（核磁共振）方法为普洱茶的品质评价找到新思路。戴宇樵等[9]采用HPLC-MS（超高相液相色谱/质谱联用技术）探究云南大叶种“云抗10 号”晒青茶加工过程中代谢产物的变化，确定了影响晒青茶品质形成的标志性代谢物。

保靖黄金茶产于湖南湘西，其内含物质丰富、氨基酸含量高，所制绿茶“香、绿、爽、浓”，红茶则“汤色红艳、香高味浓”[10−11]。目前，关于黄金茶工夫红茶的各方面研究都相对较少，探究其品质形成原因的研究更为稀少。基于此，本研究采用黄金茶为原料制作成工夫红茶，利用代谢组学的液质联用技术（LCMS/MS）探究其发酵过程中代谢产物的变化，以期为湖南工夫红茶加工过程中的品质调控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜叶原料 均采自湖南湘西妙古金茶叶公司茶园，品种为保靖黄金茶，原料等级为一芽二叶，采摘时间为2020 年8 月上旬；甲醇、醋酸铵 色谱级，Thermo 公司；水 Merck 公司；甲酸 Fisher 公司。

Q Exactive™ HF-X 质谱仪、Vanquish UHPLC色谱仪 Thermo 公司； Hypesil Gold column C18（100 mm×2.1 mm, 1.9 μm）色谱柱 Thermo Fisher 公司；D3024R 低温离心机 Scilogex 公司；凉青架、凉青筛、55 型揉捻机 福建佳友公司；链板式烘干机 四川省农副产品加工技术开发公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品加工工艺 萎凋：准确称取25 kg 鲜叶，进行室内萎凋（鲜叶薄摊2～3 cm，平均气温20 ℃）；揉捻：待萎凋至鲜叶含水量为62%～63%时，将萎凋叶转入55 型揉捻机进行揉捻（不加压5 min、轻压10 min、重压10 min、轻压5 min、重压10 min、轻压5 min）；发酵：将揉捻叶转入发酵室进行发酵（环境温度28 ℃、相对湿度90%以上，发酵4 h）；干燥：发酵后，采用链板式烘干机进行干燥（毛火温度120 ℃、足火温度100 ℃，干燥至成品茶含水量为4%～5%止）。取样：工夫红茶发酵过程中，于发酵0、2、4 h 分别取样，记为FJ0h、FJ2h、FJ4h；随后将样品迅速用液氮固定、置于-80 ℃储存待进一步分析。每组样品包含3 个生物学重复。

1.2.2 代谢物提取 取100 mg 液氮研磨的组织样本，置于EP 管中，加入500 μL 含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，涡旋振荡，冰浴静置5 min，15000 r/min、4 ℃离心10 min，取一定量的上清液加质谱级水稀释至甲醇含量为53%，并置于离心管中，15000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液，进样LC-MS 进行分析[12]。

质控（QC）样本：每组待测样本中的三个生物学重复样品分别取等体积的样本混匀制成QC 样本，每组茶叶样品均独立制备质控样品，用于平衡色谱-质谱系统和监测仪器状态，在整个实验过程中对系统稳定性进行评价。

空白（blank）样本：含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液代替实验样本，前处理过程与实验样本相同，主要用于去除背景离子。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Hypesil Gold column C18（100 mm×2.1 mm,1.9 μm）、柱温：40 ℃、流速：0.2 mL/min、正离子模式：流动相A：0.1%甲酸、流动相B：甲醇；负离子模式：流动相A：5 mol/L 醋酸铵，pH9.0；流动相B：甲醇，洗脱条件如表1 所示。

表1 色谱梯度洗脱程序Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

1.2.4 质谱条件 扫描范围选择m/z 70～1050；ESI 源的设置如下：喷雾电压：3.2 kV；鞘层气体流速：40 arb；辅助气体流量率：10 arb；毛细管温度：320 ℃；极性：正，负；MS/MS，二级扫描为数据相关扫描。

1.3 数据处理

下机原始数据使用CD3.1 软件根据保留时间、质荷比等参数进行数据预处理。对于不同样本，根据保留时间偏差和质量偏差（Part per million, ppm）进行峰对齐；随后根据设置的ppm、信噪比（Signal-tonoise ratio, S/N）、加合离子等信息进行峰提取，并对峰面积进行定量。然后比对高分辨二级谱图数据库mzCloud、mzVault 以及MassList 一级数据库检索（数据库由北京诺禾致源生物科技股份有限公司提供），进行代谢物鉴定。用Blank 样本去除背景离子，并对定量结果进行归一化，最后得到数据的鉴定和定量结果。保留QC 样本中变异系数（Coefficient of Variance, CV）小于30%的代谢物作为最终的鉴定结果，进行后续分析[13]。主成分分析采用SIMCA 14.1软件进行分析，数据分析采用Excel 2019 及SPSS 22.0 软件，热图绘制使用TBtools 软件。

2 结果与分析

2.1 主成分分析

以三个样品组（正离子模式和负离子模式检测结果合并）的代谢物进行主成分分析，根据离散度分析样品重复性及差异性，判断仪器稳定性和数据有效性。若样品离散度小，则仪器稳定，检测结果可靠。如图1 所示，三个样品组明显分开，插入的QC 样本可以很好的重叠，说明仪器具有较好的稳定性。且样品组内生物学重复样品离散度小，表明生物学重复样品的重复性好，具有代表性，为后续代谢物分析结果的准确提供了依据。另外，由图1 可知，工夫红茶发酵过程中代谢物逐渐变化。发酵0 h 样品与发酵2、4 h 样品距离较远，而发酵2 h 与发酵4 h 样品组较为接近。由此可见，发酵前期物质变化明显，提示发酵前期是工夫红茶品质形成的关键阶段。

图1 工夫红茶发酵过程中代谢物主成分分析得分图Fig.1 Principal component analysis scores of metabolites during the congou black tea fermentation

2.2 差异代谢物分析

本次实验共检测到1415 种代谢物（正离子模式和负离子模式检测结果合并），参考岳文杰等[14]、Yue 等[15]的数据处理方法，利用SPSS 软件，以1415个代谢物的响应强度（峰面积）为指标，进行单因素方差分析，以获得每个代谢物的P值，并以P<0.05（Bonferroni 校正）筛选工夫红茶发酵过程中的差异代谢物，共筛选到493 个差异代谢物。对获得的所有差异代谢物进行层次聚类分析，这些差异代谢物在发酵过程中的变化规律如图2 所示。在发酵过程中，493 个差异代谢物的含量变化趋势主要分为四个类型：第一类呈现“较高→高→较低”的变化趋势，这类代谢物在发酵前期含量较高，随着发酵的进行逐渐降低；第二类呈现“较高→低→较低”的变化趋势，在发酵前期的含量最高，而随着发酵的进行，含量不断下降，特别是发酵至4 h 时，含量出现比较明显的下降趋势；第三类呈现“较低→高→较高”的变化趋势，这类代谢物在发酵前期的含量低，而发酵至2 h 时含量明显上升，直至发酵结束；第四类呈现“较低→低→较高”的变化趋势，这类代谢物直至发酵后期，即发酵至4 h，含量才明显上升。此外还对两组间的差异代谢物进行统计分析，如表2 所示。结果显示，FJ2 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ0 h、FJ4 h vs FJ2 h 分别筛选到206、482、112 个差异代谢物，其中上调表达的分别有175、368、81 个，下调表达的分别有31、114、31 个。综上所述，工夫红茶发酵过程中，差异代谢物变化趋势明显，且发酵过程中上调的差异代谢物数量均大于下调的差异代谢物数量；发酵2 h 后代谢物明显差异于发酵0 h；发酵前期差异代谢物数量多于发酵后期，物质代谢更加活跃。

表2 各组间代谢物差异筛选结果Table 2 Screening results of metabolite differences among groups

图2 工夫红茶发酵过程中总差异代谢物的变化热图Fig.2 Heat map of changes in total differential metabolites during the fermentation of congou black tea

2.3 不同类别差异代谢物的鉴定与分析

以上述493 种差异代谢物进行定性分析，共鉴定到90 个代谢物，包括15 种儿茶素及其聚合物、22 种氨基酸、10 种有机酸、3 种核苷、20 种黄酮醇及其糖苷、12 种生物碱、8 种可溶性糖。

2.3.1 儿茶素及其聚合物类物质的变化分析 如图3 所示，15 种鉴定到的具有差异变化的儿茶素及其聚合物：（-）-EGC（（-）-Epigallocatechin）、CG（Catechin gallate）、（-）-EGCG（（-）-Epigallocatechin gallate）、EC（Epicatechin）、ECG（Epicatechin-3-Ogallate）、ETFGg（Epitheaflagallin 3-O-gallate）、（-）-GC（（-）-Gallocatechin）、C（Catechin）、（-）-CG（（-）-Catechin Gallate）、EGC（Epigallocatechin）、茶黄素-3,3'-双没食子酸酯（Theaflavine-3,3-digallate）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin monogallate）、原花青素A2（Procyanidin A2）、原花青素B2（Procyanidin B2）、原花青素B1（Procyanidin B1）。在发酵过程中，这15 种物质表现为两种变化趋势，第一种：儿茶素类与原花青素类物质呈明显下调趋势；第二种：茶黄素类物质呈显著上调趋势，这与前人的研究结果一致[16−18]。茶黄素是红茶特有的代谢物，对红茶茶汤滋味和色泽品质起着决定性的作用，在红茶发酵时，儿茶素与酶结合发生酶促氧化生成大量茶黄素类物质[19]，故在此过程中可观察到儿茶素类物质的大幅度下降以及茶黄素类物质的明显增加。原花青素是以儿茶素单体为结构单元构成的一种二聚体化合物，广泛存在于自然界的众多植物中。茶叶不同的加工方式会导致其含量发生明显变化，其中以绿茶中原花青素含量最高，红茶和黑茶最低[20−22]，表明原花青素含量随茶叶的发酵程度的加深而减少，这在本实验中得到了证实。原花青素含量在红茶发酵过程中逐渐降低，初步推断可能是原花青素在红茶发酵环境下发生了氧化导致其含量下降，但其氧化机理有待进一步解析。

图3 工夫红茶发酵过程中儿茶素及其聚合物的变化Fig.3 Changes of catechins and their polymers during the fermentation of congou black tea

2.3.2 氨基酸类物质的变化分析 氨基酸作为茶叶中重要的化学成分，与茶叶的品质和营养价值密切相关。目前，从茶叶中已鉴定出的氨基酸共有26 种。按照滋味特征划分，茶叶中的氨基酸主要包括鲜甜的茶氨酸，鲜酸的谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，甜味的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸，苦味的精氨酸[23−24]。其中茶氨酸是茶叶中含量最高的氨基酸，也是茶叶的特有成分[25]。茶叶的风味口感主要由谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸等鲜味和鲜爽类的氨基酸决定[26]。此外，高温条件下氨基酸可脱水释放烘烤香，也可在高温低湿条件下与糖类发生美拉德反应，产生焦糖香[23]。

如图4 所示，在发酵工序中，鉴定到的22 种差异表达的氨基酸，除L-苏氨酸呈现波动变化外，其余氨基酸都呈极显著变化，产生大幅度下调，这与从前关于氨基酸变化规律的研究结果相似[27−28]。有研究指出，红茶加工过程中，氨基酸含量的下降可能是由于其转化成了其他物质，并认为有两种可能的途径可以将游离氨基酸转化为茶叶香气化合物或挥发性化合物。一是氨基酸与儿茶素氧化产物—邻醌结合，二是一些氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等，部分转化为醛、醇等物质[27,29−30]。

图4 工夫红茶发酵过程中氨基酸类物质的变化Fig.4 Changes of amino acids during the fermentation of congou black tea

2.3.3 黄酮醇及其糖苷类物质的变化分析 黄酮类化合物是茶叶中一类低分子量的酚类化合物，分为黄酮、黄酮醇。红茶中的黄酮类物质主要是异黄酮、黄烷酮和黄酮醇等[31]。大多数情况下，黄酮醇常与糖结合成糖苷以碳糖基的形式存在，茶叶中黄酮醇类主要以槲皮素（苷）和山奈素（苷）和杨梅素（苷）的形式存在[32−33]。据报道，在红茶茶汤中，除了儿茶素外，一系列的黄酮-3-醇吡喃糖苷也是影响红茶口感的重要因素[34−35]。这类黄酮-3-醇苷在极低的阈值浓度下不仅能产生天鹅绒般的苦涩感，还能通过增强咖啡碱的苦味强度促进红茶茶汤的苦味。

如图5 所示在本研究的工夫红茶发酵过程样中共鉴定到20 种差异表达的黄酮及其糖苷物质，包括15 种黄酮醇：车前草苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷二氢查尔酮、高丽槐素、槲皮素、异鼠李素、二氢槲皮素、异丹叶大黄素、二氢杨梅素、杨梅素、异甘草苷、山奈酚、橙皮素、矢车菊素、熊果苷；5 种黄酮醇糖苷：杨梅素3-O-β-D-半乳糖苷、花青素鼠李葡糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷。工夫红茶发酵过程中，这20 种物质的变化趋势分为三种类型，第一类：发酵2 h 后下调表达（二氢槲皮素、二氢杨梅素、杨梅素、异甘草苷、矢车菊素、杨梅素3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-D-木糖甙、槲皮素-3,4’-O-D-β-葡萄糖苷）；第二类：发酵2 h 后上调表达（车前草苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷二氢查尔酮、高丽槐素、槲皮素、异丹叶大黄素、橙皮素、熊果苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷）；第三类：发酵2 h 后上调表达，发酵4 h 后下调表达（异鼠李素、山奈酚、花青素鼠李葡糖苷）。Guo 等[36]进行了PPO+POD 处理黄酮糖苷的体外研究，验证了PPO、POD 能促进茶叶中黄酮糖苷的转化，从而导致其含量的下降。但目前针对茶叶加工过程中黄酮醇及其糖苷物质变化的研究较少，因此，对于工夫红茶发酵过程中黄酮醇及其糖苷类物质具体的变化机理还需做进一步探索。

图5 工夫红茶发酵过程中黄酮醇及其糖苷类物质的变化Fig.5 Changes of Flavonols and their glycosides during the fermentation of congou black tea

2.3.4 生物碱类物质的变化分析 茶叶中的生物碱以嘌呤类为主，其中，含量最多的是咖啡碱（2%～5%）[37]。咖啡碱是一种结构为1,3,7-三甲基黄嘌呤的生物碱，是茶叶中重要的生物活性成分和呈味物质，一般茶叶品质越好，咖啡碱含量越高[38]。咖啡碱呈苦味，且阈值较低，据研究表明，多酚类物质可增强其苦味强度，而氨基酸则能减弱其苦味强度[39]。茶汤中含有丰富复杂的化合物种类，既存在氨基酸，也包括多酚类物质，会对茶汤中咖啡碱的呈味产生综合影响[40]。

如图6 所示本次研究共鉴定到12 种差异表达的生物碱，前人重点研究关注的咖啡碱、可可碱、茶碱也包括其中。咖啡碱在发酵过程中呈现先上调后下调的变化趋势，而可可碱和茶碱则是表现先下调后上调的变化趋势。这与先前的研究结果略有出入，初步推断，这可能与茶叶加工工艺及品种不同有关[41−42]。其余生物碱，除大麦芽新碱与山蜡梅碱外，均是上调表达。

图6 工夫红茶发酵过程中生物碱类物质的变化Fig.6 Changes of alkaloids during the fermentation of congou black tea

2.3.5 其他类物质的变化分析 此外，还鉴定到了10 种有机酸、3 种核苷以及8 种可溶性糖。可溶性糖是茶叶中主要的水溶性碳水化合物[43]，其主要包括三类，可溶于水的单糖（果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木酮糖和阿拉伯糖等）和双糖（蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖等），以及不溶于水的多糖（淀粉、纤维素、半纤维素、木质素和果胶），单糖和双糖均具有甜味[37]，一定程度上能削弱茶汤的苦涩[44]，是构成茶汤甜醇滋味的物质基础之一。在本实验中，D-阿拉伯糖、蔗糖、水苏糖、纤维三糖、D（-）-来苏糖、L（-）岩藻糖、D-木糖、D（-）-果糖是主要差异表达的可溶性糖类，且变化趋势为总体上调，这对工夫红茶甜醇滋味的品质形成具有重要意义。

如图7 所示10 种鉴定到的有机酸在工夫红茶发酵过程中均上调表达，3 种核苷在发酵2 h 时上调表达，发酵4 h 后下调表达。有机酸是构成茶叶香气和滋味的主要成分之一,占茶叶干物质总量的3%左右[45]。前人的研究表明，在红茶加工中，有机酸代谢对于红茶香气的形成及转化具有重要影响[46]，基于此，猜测有机酸类物质在发酵阶段的上调表达有利于红茶香气物质在加工后期的积累。

图7 工夫红茶发酵过程中其他类物质的变化Fig.7 Changes of other substances during the fermentation of congou black tea

3 结论

发酵是工夫红茶加工过程中的关键工序，在发酵过程中，丰富的内含物质发生着复杂的化学变化，为形成工夫红茶特有的品质特征奠定基础[47]。前期的研究主要集中在工夫红茶发酵工艺的改善及品质化学分析方面，对于发酵过程中众多小分子代谢产物的变化规律仍不清晰[48−49]。

本实验采用基于代谢组学的液质联用技术（LCMS/MS）对工夫红茶发酵过程中的代谢物进行鉴定分析，实现了对发酵各个阶段的明显区分，同时发现，在发酵过程中，工夫红茶的代谢物含量变化以发酵2 h 和发酵4 h 为时间节点，分为发酵前期（0～2 h）和发酵后期（2～4 h）。在这两个不同的发酵阶段，上调的差异代谢物数量均大于下调的差异代谢物数量；发酵2 h 后代谢物明显差异于发酵0 h；发酵前期差异代谢物数量多于发酵后期，物质代谢更加活跃，暗示发酵前期是工夫红茶品质形成的关键阶段；此外，还对鉴定到的差异表达的代谢物进行了分析鉴定，结果显示，在整个发酵过程中，呈涩味代谢物下调表达，可溶性糖、茶黄素类呈甜醇、鲜爽滋味的代谢物明显上调表达。综上，此研究的分析结果不仅为探索发酵时间与滋味品质形成的关系提供了理论依据，同时也可以利用这些代谢物的变化规律为生产某些高含量成分的工夫红茶产品提供参考，对湖南省工夫红茶的生产实践具有一定的指导意义。但由于未采用精确定量的样品检测方法，且实验品种过于单一，本研究工作还存在许多不足。接下来应采取绝对定量的方法以及选取丰富的红茶适制品种进行研究，以期能全面解析工夫红茶发酵过程中具体物质的变化机理。