两种扣囊复膜酵母在清香型麸曲白酒生产中的应用

马美荣，刘小改，李洪媛，周林艳，单 群，王小伟，张 坤

（北京红星股份有限公司，北京 101400）

扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）属于复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae），复膜孢酵母属（Saccharomycopsis），又名拟内孢霉，是一类能产生子囊孢子的二形态酵母[1]，其通过多极出芽、菌丝体形成来增殖，子囊为球状，游离于体细胞或附着于菌丝尾部或壁上。每个子囊可形成两个到四个帽状子囊孢子，成熟时释放[2]。扣囊复膜酵母可在各种淀粉基质中存活，是白酒酒曲[3−5]、黄酒酒药[6]、甜酒曲[7]、韩国酒曲Nuruk[8−10]、泰国酒曲Loog-pang[11]、食醋大曲[12−13]等酒曲中的重要菌种。

麸曲酒是以麸曲为糖化剂，加酵母（酿酒干酵母）为发酵剂，或以麸曲为糖化发酵剂酿制而成的白酒[14]。清香型麸曲白酒是以黑曲霉制备的麸曲为糖化剂，酿酒酵母为发酵剂酿制而成。由于该麸曲白酒发酵菌种较为单一，酒体辛辣，欠醇厚绵柔，后味短，限制了一部分消费者对麸曲酒的喜爱。扣囊复膜酵母能够产生一定的香气，能产生多种甜味物质，其应用于清香型麸曲白酒发酵，能够改善麸曲酒的醇甜感，提升原酒的品质。

本文以优选的两株扣囊复膜酵母制备麸曲，对麸曲进行感官评价、风味成分分析，并对其产酸能力、糖化力、发酵力进行分析研究。扣囊复膜酵母麸曲应用于清香型麸曲白酒发酵，研究其对清香型麸曲白酒出酒率、原酒品质的影响。通过酒样风味成分的分析，为扣囊复膜酵母提升原酒品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

扣囊复膜酵母T（Saccharomycopsis fibuligeraT，简称NT）、扣囊复膜酵母L（Saccharomycopsis fibuligeraL，简称NL）、酿酒酵母 HX006（Saccharomyces cerevisiaeHX006） 北京红星股份有限公司分离保存；高粱、稻壳、酿酒麸曲 北京红星股份有限公司酿造车间生产提供。

HP6890 气相色谱仪 安捷伦公司；LA230S 电子天平 赛多利斯公司；LRH-250 生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；DMA5000M 全自动密度仪 安东帕公司；ICS-3000 离子色谱仪 美国Dionex公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备 扣囊复膜酵母种曲、浅盘麸曲培养基[15]：麸皮与水以1:1 比例拌匀，121 ℃灭菌30 min；扣囊复膜酵母发酵力培养基[16]：参考酿酒大曲发酵力分析方法，选用葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液：1 kg 玉米面加入5 L 水，加入0.02%的液化酶在80 ℃保温液化1 h，降温至60 ℃加入0.3%的糖化酶保温糖化2 h，弃去残渣，清液121 ℃灭菌20 min；酵母液体种子培养基[17]：按照发酵力培养基制备方法制备玉米糖化液，根据原液的糖度降度到10oBrix，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 扣囊复膜酵母三角瓶种曲制备 根据1.2.1 配制扣囊复膜酵母种曲培养基，250 mL 三角瓶中装入20 g 麸皮、20 mL 水，拌匀，121 ℃灭菌30 min。降温至30 ℃左右，从扣囊复膜酵母斜面挑1～2 环菌接入培养基中，30 ℃培养箱培养3～4 d。

1.2.3 扣囊复膜酵母浅盘麸曲制备 根据1.2.1 配制扣囊复膜酵母浅盘麸曲培养基，取1 kg 麸皮、1 L水，拌匀，121 ℃灭菌30 min。降温至35 ℃左右，接入6～10 g 种曲，拌匀后装入浅盘，在曲室内培养，前期（0～24 h）品温控制在32 ℃左右，后期（24～40 h）品温控制在36 ℃左右。

培养好的麸曲置于阴凉、干燥、通风处贮存，贮存时间不超过2 个月。

1.2.4 扣囊复膜酵母在清香型麸曲白酒生产中的应用

按照糖化发酵剂组成分为三个方案进行发酵实验，以不加扣囊复膜酵母麸曲为对照。

对照：酿酒麸曲8%、酿酒酵母4%；方案1：酿酒麸曲8%、酿酒酵母4%、NT 麸曲1%、NL 麸曲1%；方案2：酿酒麸曲8%、酿酒酵母4%、NT 麸曲2%；方案3：酿酒麸曲8%、酿酒酵母4%、NL 麸曲2%。

酿酒酵母斜面接种于装有酵母液体种子培养基的液体试管中，28 ℃培养24 h，培养好的液体试管种子液转接于装有酵母液体种子培养基的液体三角瓶中，28 ℃培养20～24 h。

操作要点：将高粱粉碎成粉状，酒糟、高粱粉按照4:1 的配比混合均匀，加入稻壳、水，稻壳添加量为高粱粉质量的25%，适当加水调节醅料水分至55%左右，拌匀后闷料30 min，然后100 ℃蒸粮40 min，蒸粮完成后物料经摊凉、降温至30 ℃左右，按高粱粉质量50 kg 加入相应的麸曲、酵母，并再次翻拌均匀后入0.8 m3槽车发酵。自然发酵，发酵7 d。发酵完成后，将酒醅从槽车中取出，装入甑锅中蒸馏取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作为丢糟弃用，剩余80%酒糟作为回糟再次配粮后进行后续发酵应用。蒸馏后的酒样进行风味成分分析和感官评价。

1.2.5 扣囊复膜酵母麸曲感官评价 取培养成熟的麸曲，由8 位具有专业知识的技术人员（年龄20～50岁，5 男3 女，高级酿酒师5 人，酿酒师3 人）观察成曲颜色、表面及断面生长情况，并闻其香气情况[18−19]。

成曲评价标准：颜色发白，表面及断面皆有白点，结块较密，无酸臭味、无杂菌感染现象。

1.2.6 气相色谱分析风味成分

1.2.6.1 样品前处理 取10 g 绝干的麸曲样品置于磨口三角瓶中，加入200 mL 70%voL 的乙醇溶液，室温浸泡24 h，取清液备用。白酒样品不需前处理。

1.2.6.2 色谱条件 DB-WAX UI 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），检测器温度240 ℃；进样口温度250 ℃；升温程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min 升至100 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持13 min；载气为氮气（N2）；吹扫流量为3 mL/min；分流比为1:30。载气流速：氮气36.5 mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min。根据保留时间定性，采用内标法定量，内标物为叔戊醇（质量浓度198.27 mg/L）、乙酸正戊酯（质量浓度174.93 mg/L）和2-乙基丁酸（质量浓度198.20 mg/L）。

1.2.7 多元醇分析

1.2.7.1 样品前处理 取样品2.00 g 及30 mL 蒸馏水，置于50 mL 离心管中，2000 r/min，15 min，取上清液备用。

1.2.7.2 色谱条件 CarboPac MA1 型分离柱（250 mm×4 mm）；流动相：480 mmol/L NaOH 淋洗液；柱温：30 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：25 μL；电化学检测器和Chromeleon 6.80 色谱工作站[20]。根据保留时间定性，外标法定量。

1.2.8 扣囊复膜酵母麸曲酸度测定 称取试样10 g（精确至0.01 g），于250 mL 烧杯中，准确加水100 mL，于室温浸泡30 min（每隔10 min 搅拌1 次），用脱脂棉过滤后的清液进行酸度测定[21]。

酸度定义：每100 g 曲消耗1 mmol 氢氧化钠为1 度酸度。

1.2.9 扣囊复膜酵母麸曲糖化力测定 称取5 g 麸曲样品，加入90 mL 水和10 mL 醋酸-醋酸钠缓冲溶液，搅匀。35 ℃水浴1 h，用脱脂棉过滤，弃去最初5 mL，接收其余澄清滤液进行淀粉酶解糖测定，测定方法参照斐林定糖法[22]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗标准葡萄糖溶液的体积（mL）；V 表示加麸曲糖化液后消耗标准葡萄糖溶液的体积（mL）；C 表示标准葡萄糖溶液浓度（g/mL）；糖化酶活力为U/g。

糖化酶活力单位：1.0 g 干曲在35 ℃、pH4.6 条件下，反应1 h，将可溶性淀粉分解为葡萄糖1 mg 所需的酶量称为1 个酶活力单位，符号为U。

1.2.10 扣囊复膜酵母麸曲发酵力测定 以葡萄糖含量128 g/L 的玉米糖化液为发酵培养基，按照酿酒大曲发酵力测定方法测定[16]。

发酵力活力单位：在30 ℃，72 h 内0.5 g 麸曲利用可发酵糖类所产生的二氧化碳克数为一个单位，符号为U。

1.2.11 酒样酒精度测定 样品使用Anton Paar DMA 5000 M 全自动密度仪进行自动检测[23]。

1.2.12 原料出酒量、出酒率的测定 蒸馏后的酒样称重，测定原酒酒样的酒精度，计算出酒量、原料出酒率。

出酒量（kg）=原酒酒样酒精度折算为65%voL原酒的换算系数×原酒产量

原料出酒率（%）=折算为65%vol 原酒产量/原料用量×100[17]。

1.2.13 酒样感官评价 根据GB/T 33404-2016 白酒感官品评导则进行品评描述[24]。由10 位具有专业知识的技术人员（年龄20～40 岁，5 男5 女，国家品酒评委4 人，一级品酒师2 人，二级品酒师2 人，三级品酒师2 人）从原酒风味方面进行感官评价。

1.3 数据处理

所有的试验结果均以平均数±标准差（Means 士SD）形式表示，n=5，以方差分析ANOVA 来检测平均值之间的差异，以P<0.05 为差异显著。统计分析使用SPSS23. 0 统计分析软件。

2 结果与分析

2.1 扣囊复膜酵母麸曲品质和性质

2.1.1 扣囊复膜酵母麸曲感官评价 以优选的两株扣囊复膜酵母NL、NT 制备麸曲，从外观上观察两种麸曲，两者都呈白色，从颜色上无法区分，但闻香差别较大，NL 麸曲呈奶油香、花香，花香较明显，NT 麸曲呈奶油香、曲香，曲香较明显（表1），这应该与两种麸曲在培养过程中产生的香味物质种类与含量存在差异有关。

表1 扣囊复膜酵母麸曲感官评价Table 1 Sensory evaluation of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.2 扣囊复膜酵母麸曲风味物质分析 扣囊复膜酵母麸曲70%vol 乙醇提取液的气相色谱分析结果见表2，从两种麸曲中共检测到21 种物质，其中酯类化合物7 种，醛类化合物2 种，酮类化合物2 种，酸类化合物5 种，醇类化合物5 种，大部分物质呈现特殊的香气，含量较高的物质有乙缩醛、戊酸乙酯、亚油酸乙酯、乙醛、乙酸等，其中乙缩醛、戊酸乙酯和乙酸是清香型白酒中重要的风味物质。麸曲中还含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇（左旋）、2,3-丁二醇（内消旋）等物质，但含量较低。NL 麸曲的酯类物质、酮类物质、酸类物质的含量比NT 麸曲分别高6.56%、16.59%、32.28%，但其醛类物质、醇类物质的含量比NT 麸曲分别低5.67%、2.67%。

表2 扣囊复膜酵母麸曲提取液气相色谱分析结果Table 2 GC analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu extraction liquid

由表3 可知，两种麸曲中含有丙三醇和阿拉伯糖醇，丙三醇的含量远高于阿拉伯糖醇的含量。NT 麸曲多元醇的含量要高于NL 麸曲多元醇的含量，约高31.79%。多元醇是形成白酒中甜味的主要来源，甜度随羟基数增多而增强。在酒精度较高的白酒中，微甜味能使酒体显得绵柔醇厚[20]。

表3 扣囊复膜酵母麸曲多元醇分析结果Table 3 Polyhydric alcohols analysis results of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.1.3 扣囊复膜酵母麸曲理化性能研究 对制备的扣囊复膜酵母麸曲进行酸度、糖化力、发酵力测定，可见所应用的扣囊复膜酵母具有一定的产酸能力、糖化能力、发酵能力。NT 的发酵力要高于NL，约高19.74%，但其酸度、糖化力要低于NL，且其糖化力远远低于NL，糖化力约低30.34%，酸度约低8.85%（表4）。

表4 扣囊复膜酵母麸曲理化指标Table 4 Physicochemical indexes of Saccharomycopsis fibuligera fuqu

2.2 扣囊复膜酵母麸曲在清香型麸曲白酒中应用

2.2.1 生产数据分析 从表5 可以看出，在不同实验条件下，与对照相比，各方案的平均出酒率都高于对照，其中方案1 的平均出酒率最高，约比对照高2.10%，相对提高了4.62%。应用扣囊复膜酵母后，平均出酒率提高，这可能与菌种具有同化淀粉能力、发酵产乙醇能力有关。

表5 不同实验方案的生产数据Table 5 The production data of different experimental schemes

2.2.2 实验酒样风味物质分析 通过气相色谱分析，从酒样中共检测到41 种物质，其中酯类化合物13 种，醛类化合物5 种，醇类化合物14 种，酮类化合物2 种，酸类化合物7 种，含量较高的物质有乙酸乙酯、异戊醇、异丁醇、乙酸、正丙醇、活性戊醇、乙缩醛、乙醛等。在清香型麸曲白酒的酯类化合物中，乙酸乙酯作为主体香味物质，是产品标准的重要指标，几个实验方案的乙酸乙酯含量都高于对照，方案1 最高，比对照相对提高了14.40%。在含量较高的醛类化合物中，几种实验方案的乙醛、乙缩醛含量都比对照高，方案3 最高，其乙醛含量比对照提高了51.84%，其乙缩醛含量比对照提高了47.72%。在醇类化合物中，一般关注高级醇（正丙醇、异丁醇、活性戊醇、异戊醇）含量变化情况，几种实验方案的高级醇含量都高于对照，方案1 含量最高，约比对照提高了14.73%。几种实验方案的酮类化合物含量都比对照高，方案3 含量最高，约比对照提高了70.80%。在酸类化合物中，乙酸含量远远高于其他酸类，几种实验方案的乙酸含量都比对照高，方案2 含量最高，约比对照提高了20.56%。

从表6 可以看出，酒样中含有可使酒具有甜感的2,3-丁二醇和1,2-丙二醇，几种实验方案的二醇物质含量要高于对照，方案1 最高，比对照提高了51.89%。由表7 可知，对照只检测到丙三醇一种多元醇，几个实验方案均可检测到丙三醇和赤藓糖醇两种多元醇，且方案1 的丙三醇含量高于对照，约提高了11.62%。

表6 实验酒样气相色谱分析结果（mg/L）Table 6 GC analysis results of experimental baijiu samples(mg/L)

表7 实验酒样多元醇分析结果Table 7 Polyhydric alcohols analysis results of experimental baijiu samples

从酒样风味物质分析来看，实验组与对照组、以及各实验组内之间风味成分的差异，一是与菌种本身特性有关，二是受发酵条件及微生物之间的相互作用影响。

2.2.3 实验酒样品评 如图1、表8 所示，从酒样品尝结果来看，实验酒样均比对照酒样增加了不同程度的绵甜感，改善了原酒的口感，提升了原酒品质。从香气、口感、谐调性等多方面评价，方案1 酒样的感官评价最好。从出酒率、理化指标、感官评价等方面综合考虑，方案1（使用两种扣囊复膜酵母麸曲）效果最好，具有推广应用价值。

图1 酒样品评风味轮Fig.1 Baijiu sample tasting wheel

表8 酒样感官品评结果Table 8 Results of sensory evaluation of baijiu samples

3 结论

扣囊复膜酵母T 和扣囊复膜酵母L 的麸曲都具有一定的产酸能力、糖化能力、发酵能力，两种酵母具有产丙三醇和阿拉伯糖醇的能力。扣囊复膜酵母应用于清香型麸曲酒发酵，能够提高原料淀粉利用率，使麸曲酒的出酒率提高，增加风味物质的种类及含量，使得原酒的绵甜感有不同程度的增强，改善了原酒的口感，提升了原酒品质。

在今后的研究中，应加强对扣囊复膜酵母在白酒酿造生产中作用机理研究，优选扣囊复膜酵母应用于酿造生产，为消费者提供饮后更舒适的美酒，满足消费者对美好生活的向往。