PGT-A前冷冻囊胚活检与新鲜囊胚活检的比较分析

张京业,张晓丽,吴克良

[山东大学生殖医学研究中心(山东大学附属生殖医院)，济南 250012]

临床上，许多患者夫妇经历着反复着床失败和早期流产的痛苦，而其所移植的胚胎有染色体异常，可能是造成这一结果的重要原因[1]。据研究，高龄患者卵子和胚胎的非整倍体率非常高[2]。事实上，40岁以上患者体外获取的卵子50%以上都是非整倍体[3]。胚胎植入前非整倍体遗传学检测(preimplantation genetic testing for aneuploidies，PGT-A)通常被用于筛选染色体正常胚胎进行移植，从而改善辅助生殖结局[4]。胚胎活检是进行PGT-A的重要前提。胚胎活检可在不同的胚胎发育阶段进行，目前常用的活检时期包括卵裂期活检[5]，极体活检[6]，桑椹胚活检[7]以及囊胚期活检[8]。囊胚期滋养层细胞活检由于其对胚胎的低损伤以及低嵌合性，是广泛应用的活检时期[9-10]。常规的PGT-A周期中，取卵后第五天(D5)或第六天(D6)进行的是新鲜囊胚活检。待囊胚发育到适合冷冻时，取部分滋养层细胞行染色体检测，该枚囊胚则需冷冻保存。若染色体结果正常，则该枚囊胚可被解冻并移植。然而在常规体外授精(in vitro fertilization,IVF)/胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)周期中，有些患者因反复着床失败、反复流产或流产物基因检测有异常而被临床大夫诊断为需进行胚胎遗传学筛查。如这些患者本周期还有剩余冷冻囊胚，则应将这些冷冻囊胚做遗传学筛查。而此时新鲜囊胚活检方法将不再适用，需将冷冻囊胚先解冻复苏，再进行囊胚活检，这种方法称之为冻胚活检法。相比较于鲜胚活检法，冻胚活检法增加了一次胚胎冷冻和复苏的过程。本研究旨在研究冻胚活检法增加的胚胎冷冻和复苏过程是否会对胚胎活检的效率和结果产生影响，探讨冻胚活检法对胚胎潜在的损伤和移植结局的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾分析2016年1月至2018年12月在山东大学附属生殖医院就诊的患者。实验组共纳入96例患者，纳入标准：助孕方式为IVF或ICSI；移植后出现胚胎停育且流产物的基因检测有异常，或有3次及以上的着床失败、早期流产；有剩余冷冻囊胚；医患沟通后患者要求将剩余囊胚行PGT-A检测。对照组为同一天进行囊胚活检的104例常规PGT-A患者,患者夫妻双方染色体没有异常，其行PGT-A的指征包括高龄、反复种植失败，反复流产及胚胎停育且流产物的基因检测有异常。对照组(鲜胚活检组):即常规的PGT-A周期，其流程为“活检-冷冻-复苏-移植”。实验组(冻胚活检组)，其具体流程为“冷冻-复苏-活检-冷冻-复苏-移植”。

1.2 囊胚冷冻复苏以及活检

1.2.1 囊胚解冻 冻存的囊胚采用玻璃化解冻程序(K-SIBW-5000，COOK公司)进行解冻。

1.2.2 囊胚活检 实验组囊胚活检流程：等复苏的囊胚扩张后，用适当的激光能量对囊胚进行简单皱缩，后用较小的激光能量对活检位置的透明带进行开缝。隔着透明带上的缝隙，利用负压将所要活检的滋养层细胞吸入活检针，再用激光沿着透明带和活检针的交接处切割滋养层，最后完全分离所需要的滋养层细胞[11]。将活检的组织送去做PGT-A检测。对照组囊胚活检流程：将D5/D6完全扩张的囊胚经上述方法活检，活检的组织送去做PGT-A检测。

1.2.3 囊胚冷冻 活检后的囊胚采用玻璃化冷冻程序(K-SIBV-5000，COOK公司)进行冷冻保存。

1.2.4 囊胚移植 待胚胎染色体检测结果出来后，经遗传咨询后选取染色体正常的囊胚进行移植。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件，连续性参数比较采用t检验，比值类数据采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 冻胚活检组与鲜胚活检组的基本概况 冻胚活检组96例患者共冷冻452枚囊胚，除去本周期之前移植的82枚，共370枚囊胚参与本研究。鲜胚活检组104例患者的328枚囊胚均参与了本研究。图1展示了两个组胚胎从活检到移植的基本流程。

图1 冻胚活检组与鲜胚活检组的基本概况

2.2 冻胚活检组与鲜胚活检组囊胚解冻后的存活情况 冻胚活检组与鲜胚活检组患者的年龄、PGT-A指征、活检囊胚数、囊胚评分、第二次解冻存活率以及总的解冻存活率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组胚胎冷冻复苏后的存活率比较

2.3 冻胚活检组与鲜胚活检组胚胎移植后的临床结局 冻胚活检组的96例患者中，76例存在染色体正常的胚胎，并进行了一次或多次移植，最终53例获得了活产结局。鲜胚活检组的104例患者中，74例进行了移植，最终49例获得了活产结局。两组的平均移植次数和活产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组胚胎移植后的着床率(P=0.630)和流产率(P=0.985)比较，差异均无统计学意义。冻胚活检组胚胎染色体的整倍体率显著高于鲜胚活检组，差异有统计学意义(P=0.027)。见表2。

表2 冻胚活检组与鲜胚活检组临床结局的比较

3 讨 论

本文中冻胚活检组对应的是IVF/ICSI周期，鲜胚活检组对应的是PGT-A周期,两组的胚胎培养过程完全一致。而囊胚的冷冻、解冻和移植操作都有成熟的体系和操作规程，由经验丰富的胚胎学家进行操作。囊胚的活检操作、活检时机的把握均由实验室顶级胚胎学家来完成，而且本研究中实验组和对照组囊胚的活检是在同一天由同一位胚胎学家完成的,最大限度减少了两组实验结果的差异性。本文中两组活检的囊胚均达到了冷冻标准。囊胚评分采用Gardner法[12]，只有评分为(4～6)BC以及以上(AA,BA,AB,BB)的囊胚才符合标准。胚胎评分是由本实验室有着丰富胚胎评价经验的胚胎学家完成的，使得胚胎质量不会影响到实验结果的准确性。综上所述，与鲜胚活检组相比，冻胚活检组的特殊性仅为增加了一次囊胚冷冻和复苏的过程。

冻胚活检的方法能得以进行，一个重要的前提就是胚胎活检方法的改进。本中心的吴克良首次提出了非提前打孔囊胚活检法[11]，该方法针对四期囊胚，利用激光打孔及透明带的束缚作用，迅速地完成滋养层组织的活检，大大减少了对囊胚发育的干预。这种新的活检方法应用到冻胚活检，只需在复苏的囊胚充分复张后就可进行活检，极大提高了活检的灵活性。

冻胚活检法针对的是IVF/ICSI周期中有剩余冷冻囊胚，但因反复种植失败或流产物基因检测有异常等，而符合PGT-A指征的患者。它使得这类患者的剩余冷冻囊胚得以利用，在一定程度上避免了开始新的PGT-A周期对患者身体以及经济上的损害。

冻胚活检方法可能存在潜在的缺陷。常规的PGT-A技术中囊胚活检过程属于侵入性操作，可能对胚胎活性产生影响。而之后的冷冻及复苏过程都有可能造成囊胚的损伤甚至死亡。而冻胚活检法对胚胎进行两次冷冻复苏过程，可能会造成更多的囊胚死亡，同时存活的囊胚发育潜能也可能受到一定影响。然而，有文献表明,合适的囊胚组织活检对胚胎的损伤很小，基本不会造成囊胚的死亡[13-14]。本实验室长期以来的囊胚活检操作结果也证实了这一点。

鲜胚活检组中囊胚只进行一次冷冻复苏过程，将其作为对照，发现冻胚活检组的总存活率为96.5%，与鲜胚活检组的98.9%相比，没有明显降低。这与文献报道的囊胚复苏存活率高达95%以上相吻合[13,15]，因此认为该方法对囊胚死亡率的影响可以接受。本研究结果显示，冻胚活检组与鲜胚活检组的胚胎着床率和流产率差异均无统计学意义，因此认为冻胚活检法对囊胚发育潜能的影响微乎其微。

本研究中两组患者的平均年龄无差异，但均大于35岁。研究表明，胚胎非整倍体的比例在>35岁的患者中显著提高[16]。因此，两组患者行PGT-A检测是有必要的。结果显示，冻胚活检组胚胎的整倍体率显著高于鲜胚活检组。表明本研究中IVF/ICSI周期的患者虽然做了PGT-A检测，但仍未达到做常规PGT-A的标准。若需开始新的周期，则需综合考虑多种因素来决定助孕方式。

综上所述，通过回顾分析本中心2016～2018年冻胚活检与鲜胚组活检的结果，认为本中心采用的冻胚活检方法安全且有效。冻胚活检法与鲜胚活检法之间互为补充，为改善PGT-A患者的临床结局作出重要贡献。