女性阴道和子宫内膜菌群与反复着床失败的相关研究进展*

刘芬婷，李 蓉

[北京大学第三医院妇产科生殖医学中心；国家妇产疾病临床医学研究中心(北京大学第三医院)；辅助生殖教育部重点实验室(北京大学)；北京市生殖内分泌与辅助生殖技术重点实验室，北京 100191]

反复着床失败(recurrent implantation failure，RIF)通常是指连续三次及以上将形态良好的胚胎移植到宫腔后，胚胎始终无法在子宫内着床的情况。RIF的病因复杂多样，一般认为与胚胎本身、母体子宫内膜容受性降低或辅助生殖技术中的治疗方案等因素相关[1]。2017年，Chen等明确发现了阴道、宫颈管、输卵管、子宫腔甚至是腹膜液中微生物的存在。该研究共收集了110例育龄女性不同生殖道部位的样本，通过16SrRNA测序发现，阴道中的标志物种是惰氏乳酸杆菌和卷曲乳酸杆菌。在输卵管中，主要发现了假单胞菌属、丹毒丝菌属以及费克蓝姆菌属的存在。在腹膜液中则存在较多的标志菌，如假单胞菌属、摩根菌属、鞘脂菌属以及漫游球均属。而在宫颈和子宫内膜中也发现了许多微生物的存在，但还无法确定核心微生物[2]。尽管已经有许多生殖道微生物紊乱导致女性生育力下降的证据，但近年来，有研究发现阴道菌群和子宫内膜菌群与辅助生殖中反复着床失败的发生有一定的关系，或能成为预测辅助生殖妊娠结局的重要指标[3-4]。因此，本文将就女性生殖道微生物包括阴道菌群以及子宫内膜菌群紊乱与着床失败之间的关系和潜在的作用机制，以及有关生殖道微生物紊乱治疗的研究进展作一综述。

1 阴道菌群与反复着床失败的关系

众所周知，乳酸杆菌是育龄期女性阴道内定植优势菌，其中卷曲乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和加氏乳酸杆菌是主要的类型。乳酸杆菌通过分解阴道内糖原产生乳酸，保持阴道内pH值在3.8～4.4之间，并且能协同其他的抗菌物质形成防御系统，抵抗病原体入侵，保持阴道内环境的健康[5]。阴道菌群特征并非一成不变，容易受到如运动量、饮食、月经周期、促排卵方案、激素药物等的影响，因此阴道菌群是因人而异，甚至随着时间改变能在同一人体内发生变化[6-7]。阴道菌群组成成分的变化，尤其是乳酸杆菌物种含量的改变，与女性生殖健康息息相关。

采集34例拟行辅助生殖助孕患者的月经周期第21天阴道分泌物，进行微生物检测及随访其辅助生殖助孕的妊娠结局。结合阴道微生物组成与助孕的妊娠结局发现，助孕后成功妊娠者与助孕失败者的阴道微生物组成之间存在显著差异。4例成功妊娠妇女的阴道菌群主要包括惰性乳酸杆菌和卷曲乳酸杆菌两种优势菌，而在其他助孕失败的患者中则有更丰富的阴道生态系统，以及更大的微生物多样性[8]。有研究通过检测胚胎移植当日的阴道菌群发现，当阴道中乳酸杆菌比例减少或阴道微生态紊乱时，会降低胚胎着床率和妊娠率[3]。2019年，一项研究发现，在RIF组中以阴道乳酸杆菌作为优势菌的患者比例减少，但是和对照组相比并无显著差异[9]。然而，2020年Fu等[4]通过16SrRNA测序发现，不明原因RIF患者的阴道乳酸杆菌与妊娠率呈显著正相关，微生物α多样性高于对照组，但惰性乳酸杆菌丰度明显低于对照组，见图1。这些证据都表明了阴道菌群确实能影响胚胎着床，但是仍需扩大样本量进一步明确阴道菌群能否成为预测胚胎着床的指标。

阴道含有许多免疫相关的细胞和受体，能感受和监督阴道环境的改变。当阴道菌群紊乱时，一些与非乳酸杆菌阴道菌群群相关的物种可能会引发免疫反应并降解宿主黏膜，增加感染的易感性，并导致不孕不育或早产等不良的妊娠结局。有研究通过构建阴道上皮和阴道菌群共培养的3D模型后发现，阿托波氏菌能增加阴道上皮膜相关黏液，引发炎症反应和免疫应答，增加与破坏阴道屏障相关的细胞因子和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)表达，如CCL20，hBD-2，白介素(IL)-1β,-6,-8和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的改变,从而影响女性生殖健康[10]。女性生殖道中，AMPs在屏障功能和宿主防御中起着关键作用，能调节下生殖道的阴道菌群，防止下生殖道微生物进入上生殖道[11]。异常的阴道菌群如阿托波氏菌、加德纳菌等能产生生物膜，导致乳酸杆菌无法定植到腔上皮表面，减少乳酸的表达，同时能导致如HBD2、HE4、CCL20、SLPI、HLPN1-3等抗菌肽的异常表达，间接影响着床的过程，导致胚胎着床的失败[11]。此外，Fu等[4]研究还发现，相比于对照组，2',3环状UMP和磷酸二醇是RIF组中含量较高的两种代谢物，而甘油磷脂和苯吡喃是RIF组中含量较低的两种重要代谢物，这两种代谢物对着床和维持妊娠都具有重要的意义。苯吡喃作为一种选择性雌激素受体调节剂，能影响子宫内膜容受性，在RIF患者中表达量明显降低[12]。RIF患者阴道代谢物组成的变化可能是由微生物组成变化所致，这可能是导致RIF发病的重要机制之一[4]。然而，目前阴道菌群对胚胎着床的作用机制复杂且还未完全明确，仍需进一步建立更加完善的阴道-内膜-微生物的模型，动物模型和临床试验以证实阴道菌群对胚胎着床的影响和机制。

图1 反复着床失败患者阴道及子宫菌群的改变及其潜在机制示意图

2 子宫内膜菌群与反复着床失败的关系

随着细菌培养技术及高通量测序的发展，子宫内存在微生物已被普遍接受[13]。Moreno等研究发现，子宫内膜液中存在多种微生物甚至包含一些在阴道中未被发现的微生物，子宫内膜液中的微生物种类明显比阴道菌群中多，这也证实了子宫内膜本身就存在定植微生物，并非完全是阴道菌群的延续[9,13]。然而，目前还未发现核心子宫内膜菌群,而是将子宫内膜菌群分为正常共生菌群和致病的异常菌群。在子宫内膜上皮细胞紧密连接形成完整的屏障以及黏液中抗菌肽的作用下，正常的共生微生物一般不会产生有害的影响,甚至可保护子宫内膜和促进子宫内膜发育，而异常的致病菌则可能导致子宫内膜功能受损引起子宫内膜炎症、着床失败和不孕的发生[14]。

研究发现，子宫内膜定植了除乳酸杆菌以外的其他多种微生物时，导致不良妊娠结局的发生[8]。一项研究收集了33例不同种族患者在胚胎移植当日的内膜微生物，分析发现子宫内膜菌群由278个属组成，其中黄质菌属和乳酸杆菌是最丰富的属[15]。研究还发现，子宫内膜菌群在胚胎围着床期处于高度稳定的状态，但是一旦宫腔菌群组成改变或失调,则会使非乳酸杆菌为主的其他菌种增加，而以非乳酸杆菌为主(Non-Lactobacillus dominated,NLDM，<90%乳酸杆菌属，>10%的其他菌属)的患者相比于以乳酸杆菌为主(Lactobacillus dominated,LDM,>90%乳酸杆菌属)的患者，其胚胎着床率、临床妊娠率以及活胎率明显降低[13]。一项研究纳入了92例拟进行体外授精的不孕患者，通过检测患者子宫内膜液微生物的改变，进一步证实不孕症患者子宫内膜菌群主要以非乳酸杆菌(NLDM)为主，并且发现提高子宫内膜乳酸杆菌含量可能有利于NLDM不孕患者的着床[16]。此外，Kitaya等在RIF患者的子宫内膜液中发现了伯克霍尔德菌属，而对照组并未发现。该研究还发现，RIF组相比于对照组，加德纳菌的检出率增加[9]。通过检测子宫内膜组织及宫腔灌洗液中的微生物发现，透析菌、双歧杆菌、普氏菌、加德纳菌和厌氧球菌等18种微生物在慢性子宫内膜炎中的丰度增高[17]。宫腔镜下诊断为慢性子宫内膜炎的RIF患者，经抗生素治疗后，其着床率和持续妊娠率明显增加[18]。因此，子宫内膜微生态失调导致的慢性子宫内膜炎或许是降低子宫内膜容受性，导致反复着床失败发生的重要原因之一。微生物的相关治疗或能改善反复着床失败及辅助生殖的妊娠结局，但仍需要更多的临床证据证实。

2.1 子宫内膜微生物与免疫应答 人体子宫内膜是天生免疫防御的重要部位，包含了大量的免疫细胞(NK细胞，T细胞以及巨噬细胞等)，能分泌各种免疫分子和细胞因子，在胚胎着床、内膜蜕膜化及维持妊娠中有重要的作用[19]。因此，子宫内膜菌群或能通过调节免疫系统的功能，改变子宫内膜容受性，影响胚胎着床和妊娠。

有研究发现，子宫内膜的微生物拟杆菌中含有多糖A,可调节Th17的反应，促进CD4+Th1细胞的表达[20]。Th1细胞分泌的干扰素IFN-γ，IL-12和TNF-β,Th17细胞分泌的IL-17和IL-22等细胞因子，以及一些共生微生物如乳酸杆菌等能募集调节T细胞(regulatory T cell,Treg)，从而激活巨噬细胞，增强炎症反应，对妊娠起着重要作用[21]。目前，大部分研究集中于微生物与T细胞的相关性。然而，有研究发现81.7%的RIF患者表现出子宫内膜免疫特征的异常，其中包括子宫内膜uNK细胞的动员、激活和成熟的异常[22]。在伴有慢性子宫内膜炎的RIF患者中，子宫内膜CD68+巨噬细胞,CD83+成熟树突状细胞,CD8+T细胞和Foxp3+Treg细胞表达明显上升，而经抗生素治疗后，这些细胞比例明显下降[23]。因此，需要进一步的研究以评估RIF患者的子宫内膜菌群与uNK之间的关系，以及进一步明确子宫内膜菌群与子宫内膜免疫细胞之间的关系和互相作用机制。

2.2 子宫内膜菌群与炎症因子 微生物通过模式识别受体(recognition receptors,PRRs)感应病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，如Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体、NOD样受体(NLRs)等。子宫内膜可表达各种Toll样受体(TLRs)1-10，在分泌阶段增加，所有这些受体都能感知其特定的PAMP，并通过诱导信号级联做出反应[24]。内膜上皮细胞经脂多糖LPS刺激后，能激活线粒激活蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB信号通路，促进IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8等促炎因子的表达[25]。衣原体定植的子宫内膜能通过产生Pgp3蛋白与LL-37结合并形成稳定的复合物，中和LL-37的抗衣原活性，调节免疫反应，诱导细胞因子和趋化因子在成纤维细胞/上皮细胞中的产生和炎症细胞的招募[26]。此外，当异常致病菌侵入时，能刺激宿主细胞促进AMP分泌，抵御病原体入侵子宫内膜上皮[11]。然而，有研究通过比较NLDM和LDM患者子宫内膜中的炎症细胞因子表达发现，在含惰性乳酸杆菌的LDM患者中发现了低水平的β-防御素、cathelicidin和IL-1β，但是并无显著意义[27]。因此，仍需进一步的研究以明确子宫内膜菌群炎症反应的相关性。

微生态紊乱引起的免疫应答和炎症反应及其之间的相互作用既可直接影响胚胎着床的过程，也能通过影响子宫内膜容受性间接导致着床失败(图1)。目前有许多关于子宫内膜菌群影响着床和妊娠的假设，但是具体的作用机制尚未被明确阐述，因此仍需更深入和系统的研究。

3 生殖道菌群紊乱的治疗

有研究发现，通过联合使用抗生素和益生菌治疗细菌性阴道炎，能重塑阴道微生态的平衡，增加乳酸杆菌的含量[28]。将鼠李糖乳酸杆菌BPL005和正常育龄女性的原代内膜上皮共培养，其可产生乳酸等相关的有机酸，降低生殖道PH，还能降低IL-6、IL-8和MSP-1等水平的表达，增加IL-1RA和IL-1β的表达。当有异常致病菌存在时，这些因子表达的改变更加明显。最后，通过对鼠李糖乳酸杆菌BPL005进行局部淋巴结检测、阴道刺激测试及过敏性接触性皮炎测试发现没有细胞毒性的潜在迹象[29]。这些证据证实了鼠李糖乳酸杆菌BPL005的安全性和有效性，或能成为潜在的抗生素替代治疗方案和重要的临床辅助治疗。

此外，研究发现1例子宫内膜菌群主要以链球菌为主的RIF患者通过阿莫西林以及乳铁蛋白的治疗后，内膜菌群转为以乳酸杆菌为主的内膜环境。虽然该患者最终并未获得妊娠，但是其他NLDM患者通过抗生素联合益生元/益生菌治疗后，转为以乳酸杆菌为主的内膜环境后，最终成功获得妊娠[16]。Carlos等研究团队通过持续跟踪1例反复妊娠失败的患者发现，加德纳菌定植的内膜，可能会对甲硝唑的标准治疗产生耐药。由于加德纳菌感染的临床病程多变，容易反复发作，经反复抗生素联合益生菌的治疗，最终也并未改善妊娠结局[30]。由于临床上一部分患者即使预防性使用抗生素后，妊娠结局也无突破性改变。此外，不同微生物具有不同特性，经验性用药或使用广谱抗生素有时非但不能改善妊娠结局，反而容易导致耐药性等问题，所以在临床上需谨慎使用抗生素治疗。因此，找到关键致病微生物及其致病机制，进行针对性治疗非常关键。此外，仍需更多的临床试验和基础研究以进一步探索合适的益生菌联用抗生素方案或合适的益生菌/益生元替代治疗方案，从而改善内膜微生态环境，促进胚胎着床及改善妊娠结局。

总之，本文分别总结了阴道菌群和子宫内膜菌群与反复着床失败发生的关系及其潜在的作用机制，以及总结了生殖道微生物紊乱尤其是内膜菌群紊乱的相关治疗进展。尽管目前有许多研究已证实了女性生殖道微生态紊乱与胚胎着床的过程密切相关，但是仍需更大样本量的临床研究以改善这一领域的知识，以及深入基础研究以阐明菌群之间的关系及其作用机制，为今后关于个体菌群的研究以及为临床上不孕和反复着床患者的治疗提供更有效和准确的信息。