延龄草总皂苷通过下调miR-1470表达抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

黄远东，何 郎，赵晓平，杨大兴，徐 毅，曾祥华，刘 芳（.成都市第五人民医院，四川 成都 630；.川北医学院附属医院，四川 南充 637000）

肺癌是我国常见的一种恶性肿瘤，具有发病率与死亡率高等特点，已严重威胁人类身体健康，中药提取物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，并可抑制肺癌细胞增殖及转移[1-4]。延龄草总皂苷是延龄草中的主要活性成分，具有抗高血压等作用，研究[5]显示延龄草总皂苷可抑制宫颈癌细胞迁移及侵袭。但延龄草总皂苷对肺癌A549细胞生物学行为的影响尚未知。微小RNA（microRNA，miR）在肿瘤细胞增殖及转移等过程中发挥重要调控作用，miR-1470在食管鳞状细胞癌组织和细胞中上调表达，抑制miR-1470可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移[6]。因此，本研究主要探讨延龄草总皂苷对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其对miR-1470的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

延龄草（亳州市亿弘堂药业有限公司）；人肺癌A549细胞（美国ATCC细胞库）；Lipofectamine2000、凋亡试剂盒、MTT、Matrigel基质胶（北京索莱宝科技有限公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；antimiR-NC、anti-miR-1470、miR-NC、miR-1470 mimics（广州锐博生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Thermo Fisher公司）；反转录与荧光定量检测试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；兔抗人Ki-67、MMP-2、MMP-9抗体（美国Santa Cruz公司）；二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 延龄草总皂苷：取延龄草粉碎，使用60目筛筛选，加入70%乙醇浸泡3 h，回流提取3次（1.5 h·次-1），收集提取液后减压浓缩，冷冻干燥后得到延龄草总皂苷（纯度> 95%），根据实验需求稀释至0.5、1、2 mg·L-1。A549细胞分别加入含有上述不同浓度延龄草总皂苷的培养基内培养24 h，分别记为延龄草总皂苷低剂量组、延龄草总皂苷中剂量组、延龄草总皂苷高剂量组。同时将正常培养的A549细胞记为对照组。anti-miR-NC、anti-miR-1470分别转染入A549细胞培养24 h，分别记为anti-miR-NC组、antimiR-1470组。miR-NC、miR-1470 mimics分别转染入A549细胞后加入含有浓度为2 mg·L-1延龄草总皂苷的培养基培养24 h，分别记为延龄草总皂苷+ miR-NC组、延龄草总皂苷+ miR-1470组[7]。

1.2.2 MTT检测细胞增殖 各组A549细胞接种于96孔板（150 μL·孔-1）后加入MTT溶液（20 μL·孔-1），4 h后弃上清，加入DMSO（150 μL·孔-1）后继续培养5 min，检测各孔吸光度值（OD 490 nm）并计算细胞增殖抑制率。

1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 迁移：A549细胞加入小室的上室（200 μL·孔-1），下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液，24 h后分别加入多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，观察迁移细胞数。侵袭：Matrigel基质胶后加入小室的上室（40 μL·孔-1），后续实验步骤同迁移实验。

1.2.4 qRT-PCR检测细胞中miR-1470的表达水平 提取各组A549细胞RNA，严格按照Trizol试剂盒说明书操作，参照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，根据荧光定量PCR试剂盒说明书配置反应体系与设置反应条件，应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测miR-1470相对表达量。

1.2.5 Western blot检测Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达 提取各组A549细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入稀释比为1∶1000的一抗后置于4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗涤后加入稀释比为1∶2000的二抗，将其置于室温条件下孵育1 h，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞增殖的影响

与对照组比较，延龄草总皂苷低剂量组、延龄草总皂苷中剂量组、延龄草总皂苷高剂量组细胞增殖抑制率升高（P< 0.05），Ki-67蛋白水平降低（P< 0.05），且不同剂量组间比较差异有统计学意义（P< 0.05），见表1。

表1 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞增殖的影响. n = 9Tab 1 Effect of trillium saponins on the proliferation of lung cancer A549 cells. n = 9

2.2 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响

与对照组比较，延龄草总皂苷低剂量组、延龄草总皂苷中剂量组、延龄草总皂苷高剂量组迁移及侵袭细胞数均明显减少（P< 0.05），MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P< 0.05），且不同剂量组间比较差异有统计学意义（P< 0.05），见表2。

表2 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响. n = 9Tab 2 Effect of trillium saponins on the migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

2.3 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞miR-1470表达的影响

与对照组比较，延龄草总皂苷低剂量组、延龄草总皂苷中剂量组、延龄草总皂苷高剂量组miR-1470的表达水平降低（P< 0.05），且不同剂量组间比较差异有统计学意义（P< 0.05），见表3。

表3 延龄草总皂苷对肺癌A549细胞miR-1470表达的影响. n = 9Tab 3 Effect of trillium saponins on the expression of miR-1470 in lung cancer A549 cells. n = 9

2.4 抑制miR-1470表达对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与anti-miR-NC组比较，anti-miR-1470组细胞增殖抑制率升高（P< 0.05），迁移及侵袭细胞数均明显减少（P< 0.05），Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低（P< 0.05），见表4。

表4 抑制miR-1470表达对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响. n = 9Tab 4 Effect of inhibiting the expression of miR-1470 on the proliferation, migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

2.5 miR-1470过表达逆转延龄草总皂苷对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用

与延龄草总皂苷+miR-NC组比较，延龄草总皂苷+miR-1470组细胞增殖抑制率降低（P< 0.05），迁移及侵袭细胞数均明显增多（P< 0.05），Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高（P< 0.05），见表5。

表5 miR-1470过表达逆转延龄草总皂苷对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用. n = 9Tab 5 Overexpression of miR-1470 reversed the effects of trillium saponins on the proliferation, migration and invasion of lung cancer A549 cells. n = 9

3 讨论

近年来，越来越多的研究发现中药提取物具有抗肺癌的作用，并可通过调控多种途径或多个靶点基因而发挥作用[8-10]，以往研究证实延龄草总皂苷可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路而抑制胃癌细胞迁移及侵袭[11]，可抑制乳腺癌、宫颈癌细胞增殖并促进细胞凋亡[12-13]。有研究表明Ki-67表达水平升高预示细胞增殖能力增强[14]，本研究结果显示，延龄草总皂苷处理后的肺癌细胞增殖抑制率升高，而Ki-67蛋白水平降低，且随着药物剂量的增加而明显变化。本研究结果证实延龄草总皂苷可抑制肺癌细胞增殖，且呈剂量依赖性。MMP-2、MMP-9属于基质金属蛋白酶，其在肺癌中表达水平升高可降解细胞外基质沉积而促进细胞转移[15]。本研究结果显示，延龄草总皂苷处理后的肺癌细胞迁移及侵袭数均明显减少，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且呈剂量依赖性，提示延龄草总皂苷可抑制肺癌细胞迁移及侵袭。延龄草总皂苷能够降低肺癌细胞中miR-1470的表达水平，且随着药物剂量的增加而明显降低。研究表明miR-1470在肝癌组织和细胞中高表达，并可通过靶向ALX4而促进肝癌细胞的增殖及抑制细胞凋亡[16-17]。本研究结果证实miR-1470过表达可明显拮抗延龄草总皂苷对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。

综上所述，本研究结果显示延龄草总皂苷能够降低肺癌细胞中miR-1470的表达水平，抑制miR-1470表达可抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭，miR-1470可能作为延龄草总皂苷治疗肺癌的潜在靶点，为进一步揭示延龄草总皂苷治疗肺癌的分子机制奠定实验基础。