阿帕替尼通过ERK/JAK2-STAT3途径对MDA-MB-468荷瘤动物模型肿瘤细胞生长抑制和凋亡的影响及其作用机制探讨

佟 玲，李义慧，李 佳，王建功（.唐山市人民医院药剂科，河北 唐山 06000；.唐山市人民医院肿瘤综合治疗科，河北 唐山06000；.唐山市人民医院放化一科，河北 唐山 06000）

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一种类型，具有较高的复发性和转移性[1]，而血管生成对肿瘤的发展和转移至关重要，血管生成主要由通过血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）诱导[2]。阿帕替尼（apatinib，APA）是一种口服的小分子抗血管生成靶向药物，其可以通过与VEGFR-2结合并抑制其功能，在我国阿帕替尼已经被批准用于晚期胃癌的治疗[3]，其在乳腺癌中的应用正在进行临床试验，一项Ⅱ期临床研究结果显示大剂量阿帕替尼对于TNBC具有一定的治疗效果[4]。一项体外研究显示阿帕替尼可以抑制TNBC细胞的增殖和迁移[5]，但是关于阿帕替尼在TNBC中的作用和机制尚不明确。有体内研究显示阿帕替尼可通过抑制ERK/JAK2-STAT3抑制食管癌的进展[6]。本文旨在探讨阿帕替尼通过ERK/JAK2-STAT3途径对TNBC的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人TNBC细胞系MDA-MB-468细胞株（中国医学科学院上海细胞库）。BALB/c裸鼠（雌性，4 ～ 5周龄，SPF级，南京金陵医院）。DMEM培养基血清和抗体（美国Invitrogen公司）。阿帕替尼（美国MCE公司）。逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒（瑞士Roche公司）。anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3（美国Abcam公司）。PVDF膜（美国Bio-Rad公司）。TUNEL凋亡染色试剂盒。倒置显微镜（日本Olympus IX71）。

1.2 荷瘤裸鼠模型建立、分组及干预方法

将MDA-MB-468细胞在DMEM培养基中培养，然后将处于对数生长期的MDA-MB-468细胞消化、洗涤、重悬细胞（密度为1×107个·mL-1）。将0.2 mL的细胞悬液注射在腋下。每日观察肿瘤生成情况，在建模14 d时经过测量和计算肿瘤体积大于60 mm3提示建模成功。

选择18只建模成功的小鼠分为3组（n= 6）：对照组、低剂量APA组（4.15 mg·kg-1，qd，灌胃）和高剂量APA组（8.30 mg·kg-1，qd，灌胃）[7]。对照组小鼠使用等量的生理盐水灌胃，qd，连续14 d。

1.3 观察指标

1.3.1 肿瘤体积和质量 在干预后第14 d通过颈脱臼处死小鼠，取出肿瘤组织，擦干体液后测量肿瘤体积和质量，计算抑瘤率。

1.3.2 TUNEL染色检测凋亡 将肿瘤组织固定后透化，根据试剂盒说明书进行操作，分别进行TUNEL染色和细胞核染色，然后进行封片。其中细胞核被染为蓝色，棕色为TUNEL阳性细胞，提示凋亡，并计算凋亡率。

1.3.3 免疫组化染色检测Ki-67 将肿瘤组织用甲醛固定、石蜡包埋，切片后进行脱石蜡、水合以及抑制内源性过氧化物酶活性处理。封闭切片并在4 ℃下加入Bcl-2抗体孵育过夜，然后按照试剂盒说明书加入二抗进行显色。通过观察Ki-67的染色情况分析增殖情况。通过半定量法分析Ki-67的染色强度。

1.3.4 Western blot检测蛋白 将肿瘤组织裂解后收集总蛋白，通过BCA法测定蛋白量。每组样品取30 μg蛋白在120 V/90 min条件下进行SDS-PAGE电泳，然后将分离的蛋白转移到PVDF膜上并加入5%脱脂牛奶作为封闭溶液。分别将anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3稀释500倍，然后分别加入PVDF膜孵育过夜（< 4 ℃），加入HRP偶联二抗（1∶5000稀释）在室温下孵育1 h。ECL对蛋白进行可视化处理。

1.4 统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差表示，计数资料使用“%”表示，进行单因素方差分析，P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建模情况概述

本次研究中共使用20只小鼠建立荷瘤模型，其中18只小鼠肿瘤体积大于60 mm3，建模成功率为90.00%。

2.2 阿帕替尼对TNBC荷瘤裸鼠模型的肿瘤抑制作用

通过对各组肿瘤体积、质量进行比较，发现低剂量APA组、高剂量APA组的肿瘤体积和质量均低于对照组，差异具有统计学意义（P< 0.05）；且高剂量APA组的肿瘤体积和质量显著低于低剂量APA组（P< 0.05）。详见表1。

表1 各组肿瘤体积、质量和抑瘤率比较. n = 6Tab 1 Comparison of tumor volume, quality and tumor inhibition rate in each group. n = 6

2.3 阿帕替尼对TNBC荷瘤裸鼠模型中肿瘤细胞凋亡的影响

干预后低剂量A PA组肿瘤细胞凋亡率为（17.34±2.68）%，高剂量APA组为（24.52±3.27）%，均高于对照组的（3.16±0.58）%，差异具有统计学意义（P< 0.05）；且高剂量APA组的凋亡率显著高于低剂量APA组（P< 0.05）。

2.4 各组增殖情况比较

干预后低剂量APA组的Ki-67染色评分为（6.34±1.58）分、高剂量APA组为（4.63±1.26）分，低于对照组的（8.82±1.85）分，差异具有统计学意义（P< 0.05）；且高剂量APA组的Ki-67染色评分显著低于低剂量APA组（P< 0.05）。

2.5 各组VEGFR-2和ERK通路水平比较

干预后低剂量APA组与高剂量组的VEGFR-2蛋白表达水平和ERK蛋白磷酸化水平均低于对照组（P< 0.05）；且高剂量APA组的VEGFR-2蛋白表达水平显著低于低剂量APA组（P< 0.05）。详见表2。

表2 各组VEGFR-2蛋白表达水平和ERK蛋白磷酸化水平比较. n = 6Tab 2 Comparison of VEGFR-2 protein expression level and ERK protein phosphorylation level in each group. n = 6

2.6 各组JAK2-STAT3通路水平比较

干预后低剂量APA组与高剂量APA组的JAK2-STAT3蛋白表达水平均低于对照组（P< 0.05）；且高剂量APA组的JAK2-STAT3蛋白表达水平显著低于低剂量APA组（P< 0.05）。详见表3。

表3 各组JAK2-STAT3通路水平比较Tab 3 Comparison of JAK2-STAT3 pathway level in each group

3 讨论

TNBC的发病率占乳腺癌总数的17% ～ 20%[7]。现阶段治疗TNBC的主要方法包括手术治疗、化学疗法和放射疗法，其中化学疗法是最常用的治疗方法之一，但仍有部分患者预后不佳。近年来，抗血管生成药物在乳腺癌的治疗中取得了一定进展，临床研究发现阿帕替尼对晚期乳腺癌具有一定的疗效，且不良反应可控，但其在TNBC中的作用仍需要进一步研究[8]。小分子激酶抑制剂的发现进一步提高了对肿瘤的治疗效果，阿帕替尼是我国首个自主研发的口服药物，其在晚期胃癌中具有显著疗效[9]，与抗血管生成药物贝伐珠单抗比较，阿帕替尼具有经济、安全性高的特点[10]，最新的研究也显示其在乳腺癌中也有较好的作用[11-13]。本文通过皮下注射TNBC细胞系MDA-MB-468构建荷瘤裸鼠模型，分别使用不同剂量的阿帕替尼灌胃，发现高剂量APA组抑瘤率为（31.37±1.95）%，显著高于低剂量APA组，阿帕替尼促进肿瘤细胞凋亡和抑制增殖的能力具有剂量依赖性。有研究[14]显示阿帕替尼联合常规化疗可有效治疗TNBC，其效果和安全性良好。Li等[15]研究结果显示阿帕替尼联合卡培他滨对于晚期TNBC具有较好的治疗效果，提示阿帕替尼对于TNBC具有较好的控制作用。

VEGFR-2是促进血管和淋巴管生成的重要细胞因子，阿帕替尼的抗肿瘤活性通过抑制VEGFR-2从而抑制TNBC进展[16]。研究[17]显示VEGFR-2可以通过促进ERK通路促进肿瘤细胞的增殖。本次研究结果显示阿帕替尼可剂量依赖性的抑制TNBC荷瘤裸鼠模型肿瘤组织中的VEGFR-2、ERK通路和JAK-STAT通路。有研究显示阿帕替尼可以通过抑制ERK通路抑制胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]。Liu等[19]研究结果也显示阿帕替尼可通过抑制ERK通路提高肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。Guo等[20]发现在胃癌中，阿帕替尼耐药性的出现与JAK-STAT通路的激活有关。Ding等[21]研究结果显示阿帕替尼可通过抑制JAKSTAT通路抑制卵巢癌上皮细胞的上皮-间充质转化。以上研究提示阿帕替尼可抑制TNBC中的ERK和JAK-STAT通路。

综上所述，本研究结果显示阿帕替尼可通过抑制ERK和JAK-STAT通路抑制TNBC荷瘤裸鼠模型的肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡，但关于阿帕替尼治疗TNBC的疗效、安全性和机制仍有待进一步研究。