脂蛋白相关磷脂酶A2 基因单核苷酸多态性与急性心肌梗死的相关性△

刘亚东，冯莉莉，王海晶，齐 茗，马利军，屈晓威，王丽萍

（延安大学附属医院，延安 716000）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart dis⁃ease，CHD）患者最严重的并发症之一。早期诊断与对症治疗可降低AMI患者的病死率［1］。脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprorein-associated phosphohpase A2，Lp-PLA2）是一种新型的炎症标志物，有学者认为Lp-PLA2 具有抗动脉粥样硬化作用［2-3］。更多的研究则认为Lp-PLA2 是一种血管特异性炎症标志物，与动脉粥样斑块形成密切相关［4-6］。遗传学研究表明Lp-PLA2 活性62%受基因影响［7］，而基因的突变则增加了心血管事件的发生［8］，包括R94H、V297F、A379V 等基因位点。本研究通过研究健康人群及CHD 患者Lp-PLA2 基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），探讨遗传因素与AMI 发病的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2018 年1 月至2020 年7 月延安大学附属医院确诊的CHD 患者320 例，根据是否合并AMI分为CHD组［n=200，年龄（63±11.2）岁，男性142例，女性58 例］和AMI 组［n=120，年龄（66±11.6）岁，男性81 例，女性39 例］。所有患者均经冠状动脉造影（CAG）诊断，诊断标准符合中华医学会2012 年CHD 的诊断及分类诊断标准［9］。排除标准：（1）合并陈旧性心肌梗死、心肌病、风湿性心脏病、主动脉夹层等心脏病患者；（2）合并自身免疫性疾病、严重肝及肾功能不全、急和慢性感染、肿瘤等的患者；（3）互有血缘关系的患者；（4）精神障碍患者。选取同期在本院进行体检的表观健康体检者为健康对照（healthy control，HC）组［n=200，年龄（49±9.4）岁，男性121 例，女性79 例］。本项研究经本院伦理委员会批准以及受试者家属知情同意。

1.2 仪器与试剂

使用西门子XPT 全自动生化分析仪测定血清三酰甘油（triacylglycerol，TG）、总胆固醇（total cho⁃lesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、Lp-PLA2、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）浓度。TC、TG、HDL-C、LDL-C 使用西门子原装试剂及校准品、质控品。Lp-PLA2使用德赛试剂及配套质控品、校准品，Hcy 使用宁波美康试剂及质控品、校准品。高敏C-反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）使用深圳国赛试剂及校准品、质控品。以上项目室内质控及室间质评结果均在控；使用美国Invitrogen 公司提供的DNA 提取试剂盒和Taq DNA 聚合酶、定制引物。R92H 引物序列包括上游引物5′-CAATCACCACAGGCAGCCTAA-3′，下游引物5′-TCCCATCCAACTCAGAATGG-3′。V297F 引物序列包括上游引物5′-TCCAGTGTGG⁃GTGACTACAAA-3′，下游引物5′-TATGGGGGCA⁃AAAGAATAGC-3′。A379V引物序列包括上游引物5′-TCAAGATACCAAGCAAGAACAAGA-3′，下游引物5′-GGATGTAAAGCAGCAAAATTGA-3′。使 用3730XL 型DNA 测序仪进行测序。

1.3 资料收集

通过病例查阅的方式收集所有纳入者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、原发性高血压（高血压）、糖尿病及氯吡格雷、阿司匹林、他汀类药物、β-受体阻断药、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）等药物使用情况。

1.4 标本采集

所有受试者均采集清晨空腹静脉血各5 mL，一份使用促凝管采集，用于生化指标检测。一份使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集，离心取上清，-80 ℃保存，用于DNA 提取。

1.5 外周血DNA 提取

严格按照Invitrogen 公司DNA 提取试剂盒，使用DNA 提取试剂盒的说明书提取患者DNA，将提取到的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，测定DNA浓度。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料用（）表示，多组间比较使用方差分析，两两之间比较使用LSD-t检验；非正态分布的计量资料采用中位数表示（四分位数间距）［M（P25～P75）］，多组之间比较使用Welch 近似方差分析，多重比较使用Dunnet′s T3检验。计数资料用［n（%）］表示，使用卡方（χ2）检验。使用Logistic 回归分析，并用优势比（OR）及95%置信区间（CI）表示，OR>1 表示该因素为危险因素，OR<1表示该因素为保护因素。P<0.05 视为差异有统计学意义。经单样本Kolmogorov-Smirnov正态检验，年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C 呈正态分布（使用单因素方差分析），Lp-PLA2、HCY、及hS-CRP 呈非正态分布（使用Welch 近似方差分析）。

2 结果

2.1 3 组受试者基线资料比较

CHD 组与HC 组受试者年龄、性别、饮酒史及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP 浓度比较，差异有统计学意义（均P<0.05），其余项目比较，差异无统计学意义（P>0.05）；AMI 组与HC 组受试者年龄、吸烟史、饮酒史及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP 浓度比较，差异有统计学意义（均P<0.05）；AMI 组与CHD 组患者高血压及血清Lp-PLA2、Hcy、hs-CRP浓度比较，差异有统计学意义（均P<0.05）；详见表1。

表1 HC 组、CHD 组和AMI 组受试者的基线资料比较 ［，M（P25～P75），n（%）］

表1 HC 组、CHD 组和AMI 组受试者的基线资料比较 ［，M（P25～P75），n（%）］

注：与HC 组比较，aP<0.05；与CHD 组比较，bP<0.05；c为Welch 近似方差分析；d为χ2检验。t1为CHD 组与HC 组比较的t 值；t2为AMI 组与CHD 组比较的t 值

2.2 脂蛋白相关磷脂酶A2 与急性心肌梗死的相关性分析结果

以表1 中CHD 组与AMI 组比较P<0.05 的 变 量为自变量（赋值：是=1，否=0），以是否发生心肌梗死为因变量进行Logistic 回归分析（见表2），结果显示，高血压、Lp-PLA2、Hcy及hs-CRP均是AMI的危险因素（均P<0.05）。对高血压、Hcy、hs-CRP 等因素进行校准后发现，Lp-PLA2 仍是AMI 的危险因素（OR=4.297，95%CI：3.571～6.983，P=0.000）。

表2 AMI 的危险因素Logistic 回归分析结果

2.3 脂蛋白相关磷脂酶A2 基因型基因分布

R92H、V279F和A379V三种基因在HC组、CHD组和AMI 组受试者的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。3 组受试者的V279F 和A379V 基因频率和等位基因频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。3 组受试者的R92H 基因频率和等位基因频率比较，差异有统计学意义（P<0.05）；HC 组与CHD 组受试者基因型RH+HH 比较，差异无统计学意义（χ2=1.624，P=0.202）；AMI 组与HC 组、CHD组受试者基因型RH+HH 比较，差异有统计学意义（χ2=21.909，P=0.000；χ2=12.613，P=0.000）；HC 组与CHD组受试者等位基因H比较，差异无统计学意义（χ2=1.957，P=0.162）；AMI 组与HC 组、CHD 组受试者等位基因H比较，差异有统计学意义（χ2=17.906，P=0.000；χ2=8.837，P=0.003）。

表3 3 组受试者3 种基因型的基因分布比较 ［n（%）］

2.4 脂蛋白相关磷脂酶A2 基因多态性与急性心肌梗死的相关性

以AMI作为自变量，SHP R92H为因变量。调整年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素后发现，RH+HH 基因型和H 等位基因使AMI 风险增加（OR=2.651，95%CI：1.498～4.597，P=0.001；OR=2.055，95%CI：1.618～4.207，P=0.001）；而V279F、A379V仍与CHD（OR=0.975，95%CI：0.326～3.201，P=0.814；OR=0.922，95%CI：0.415～4.118，P=0.647）和AMI（OR=0.899，95%CI：0.283～6.057，P=0.661；OR=0.911，95%CI：0.215～7.107，P=0.572）风险无关。

2.5 分层分析

以年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症等亚组对R92H 和AMI 风险的相关性进行分层分析，结果（表4）显示，男性患者及65 岁以上的CHD患者有更高的AMI 风险（OR=3.201，95%CI：1.507～6.992，P=0.006；OR=3.097，95%CI：1.191～7.911，P=0.007）。与吸烟者（OR=1.682，95%CI：1.228～3.696，P=0.213）相比较，不吸烟者（OR=2.177，95%CI：1.481～4.913，P=0.001）的风险更大。高血压和高脂血症使AMI 的风险增加（OR=3.391，95%CI：1.337～6.096，P=0.001；OR=3.661，95%CI：0.993～8.207，P=0.003）。

表4 分层分析结果

3 讨论

我们的前期研究发现，血清Lp-PLA2 浓度可用于辅助诊断CHD、与冠状动脉病变严重程度及病变支数相关、与冠状动脉斑块稳定性相关、可用于辅助诊断早期急性冠状动脉综合征等［10-13］。遗传学研究显示，基因会影响Lp-PLA2 活性，其中PLA2G7 多个位点基因突变会影响Lp-PLA2 活性，进而影响CHD 的发病风险。

本研究通过对HC 组、CHD 组、AMI 组进行研究发现，3 组受试者的V279F、A379V 基因型和等位基因比较，差异无统计学意义（P>0.05），在校正了年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、高脂血症等因素后仍未发现V279F、A379V与CHD（P=0.814，0.647）和AMI（P=0.661，0.572）风险有关。HC 组、CHD 组、AMI 组的R92H 基因型（RH+HH）和等位基因（H）两两比较发现，HC 组与CHD 组的基因型比较，差异无统计学意义（P=0.202，0.162），而AMI组与HC 组、CHD 组基因型（RH+HH）和等位基因（H）比较，差异均有统计学意义（均P<0.005）。调整年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症等危险因素后发现，R92H（RH+HH）和等位基因（H）使CHD 患者AMI 风险增加（均P=0.001）。Iong 等［14］研究发现，中国汉族人群V279F 位点突变可增加冠状动脉病变风险。HIFMECH 研究显示，高加索人群A379V 的变异似乎有降低欧洲人群心肌梗死的风险，显示了A379V 对CHD 的发展起保护作用［15］。2008 年杜克大学医学中心对Lp-PLA2 基因做了较全面的分析，发现A379V和R92H等位基因在CHD 组分布显著升高，调整了传统的CHD 风险后，这两个SNP 仍表现出独立相关性；进一步的研究还发现A379V 与更严重的CHD 相关［16］。对R92H 等位基因与AMI 风险的相关性进行危险分层，结果显示男性患者及65 岁以上的CHD 患者、高血压及高脂血症带来更高的AMI 风险。相对于吸烟者，不吸烟者的风险更高。而是否患有糖尿病对AMI 的风险无差异。本研究的结果与上述结果［14-16］均不相同，可能与研究对象的种族差异、研究方法的设计、样本量等选择有关。

综上，本研究结果显示CHD 患者Lp-PLA2 基因R92H 位点SNP 与AMI 的风险相关，但对于该实验的研究结果，还需要更深入地探讨Lp-PLA2 的临床切入点。