血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平与急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环分级的相关性

段毅，王坤，王军英，杨欢欢，赵平平

脑侧支循环的形成，特别是三级脑侧支循环，是一个血管新生的过程，对急性缺血性脑卒中患者病情有一定影响。近年来，微小RNA(microRNA，miRNA)在各种生理、病理过程中的作用受到广泛关注[1-2]。其中不稳定的颈动脉斑块中微小RNA-330-5p(miR-330-5p)过表达，可通过靶向踝蛋白-1参与有症状的颈动脉狭窄的发生[3]。研究发现，miR-34a-5p表达上调与急性缺血性脑卒中的发生有关[4]；血管性痴呆(vascular dementia，VD)患者血清miR-34a与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平存在关系，而VEGF是血管再生过程中的关键活性因子[5]。因此，本研究通过检测急性缺血性脑卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平，分析其与脑侧支循环分级的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年7月—2021年1月石家庄市第三医院神经内科住院治疗且建立脑侧支循环的急性缺血性脑卒中患者104例为研究组，根据数字减影血管造影(DSA)检测脑侧支循环的开放层次分组，一级侧支循环亚组36例(一级亚组，主要由Willis环血管构成)，二级侧支循环亚组51例(二级亚组，眼动脉、软脑膜及其他相对较小的侧支、侧支吻合支)，三级侧支循环亚组17例(三级亚组，通过血管生成等产生的新生供血血管)。各亚组间性别、年龄、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史、心房颤动史、抗血小板治疗及他汀治疗比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。同期纳入与急性缺血性脑卒中患者性别、年龄相匹配的健康体检者40例为健康对照组，男24例，女16例，年龄41～72(57.82±8.64)岁。研究组与健康对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准(审批号：2019051002)，全部研究对象或家属均知情同意并签署知情同意书。

表1 急性缺血性脑卒中患者不同亚组间临床资料比较 [例

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①均符合“中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018”[6]中的相关诊断流程及标准，且经颅脑CT、MR或DSA证实；②纳入对象从发病至行DSA时间≤7 d；③临床资料完整。(2)排除标准：①合并严重肝、肾功能不全者；②合并肿瘤、血液系统疾病或免疫功能障碍者；③合并冠心病、心力衰竭、心律失常等患者；④同时存在病灶对侧大脑中动脉或颈内动脉严重狭窄或闭塞者；⑤存在CT、MR或DSA禁忌证者；⑥精神状态、意识功能障碍，无法完成本研究者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平检测：研究组患者于入院24 h内、健康体检者于体检当日禁食8～12 h后，采集空腹肘静脉血5 ml，离心取上层清液于干净EP管，置于-70℃条件下保存检测。采用荧光定量PCR技术检测血清miR-330-5p、miR-34a-5p水平。首先利用Trizol试剂盒(无锡百泰克生物技术有限公司)提取血清总RNA，使用逆转录试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)得到cDNA，以cDNA为模板进行miR-330-5p、miR-34a-5p扩增。反应条件：95℃变性15 min，94℃ 15 s，退火及延伸60℃ 34 s，共40个循环。miR-330-5p、miR-34a-5p均以U6为内参。引物由无锡百泰克生物技术有限公司合成，引物序列见表2。用2-△△Ct法计算血清miR-330-5p、miR-34a-5p相对表达量。

表2 miR-330-5p、miR-34a-5p及U6引物序列

1.3.2 血清VEGF水平检测：上述血清，利用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清VEGF水平，人VEGF试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书步骤操作。

2 结 果

2.1 2组血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比较 研究组血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均显著高于健康对照组(P<0.01)，见表3。

表3 健康对照组与研究组血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比较

2.2 急性缺血性脑卒中患者亚组间血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平比较 一级亚组、二级亚组、三级亚组血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平依次升高，差异有统计学意义(P均<0.01)，见表4。

表4 急性缺血性脑卒中患者不同亚组间血清miR-330-5p、miR-34a-5p及VEGF水平比较

2.3 血清miR-330-5p、miR-34a-5p与VEGF水平的相关性 Pearson分析结果显示，急性缺血性脑卒中患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p与VEGF水平均呈正相关(r=0.674、0.624，P均=0.000)。

2.4 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平对急性缺血性脑卒中患者三级脑侧支循环建立的预测价值 以急性缺血性脑卒中一级、二级脑侧支循环患者血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平为对照，评估血清指标对三级脑侧支循环患者的预测价值，ROC结果显示，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平及三者联合预测急性缺血性脑卒中患者三级脑侧支循环建立的曲线下面积(AUC)分别为0.874、0.903、0.870、0.951，三者联合优于单独预测(Z=3.080、2.049、3.240，P=0.002、0.041、0.001)，见图1、表5。

图1 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平对急性缺血性脑卒中患者三级脑侧支循环建立的ROC曲线

表5 血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平对急性缺血性脑卒中患者三级脑侧支循环建立的预测价值

3 讨 论

急性缺血性脑卒中是人类第二大常见死亡原因，其发病率随年龄的增长而逐渐增加，是导致长期身体残疾的重要原因，给患者带来极大的经济和精神负担[7-9]。大脑血管网络的存在或缺失越来越被认为是脑卒中的重要预后原因，而传统上的研究多集中于血管再通的各个方面，很少关注脑侧支循环的作用[10-12]。脑侧支循环是指当脑部供血动脉严重狭窄或闭塞时，血液可通过侧支或新形成的血管吻合到达缺血区，使缺血区域得到不同程度的灌注代偿[13-15]。既往研究发现[16-17]，多种基因和蛋白参与急性缺血性脑卒中的发生发展，其对脑侧支循环的作用目前知之甚少。

miRNA主要在转录后通过miRNA的互补序列识别并靶向mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)参与调控基因表达[18-19]。脑内主要侧支通路是Willis环的后、前交通(侧支)动脉，前、中、后大脑动脉树冠间的pial小动脉吻合及小脑后动脉与小脑上动脉、小脑远端动脉之间的穹窿吻合，有助于减轻缺血症状，保护神经元功能[20]。有报道称，miR-330-5p在神经系统中靶向细胞分裂周期蛋白42(CDC42)表达，参与阿尔茨海默病发病过程中神经元对抗突触缺失的代偿作用[21]。脑侧支循环的形成，尤其是三级脑侧支循环，实际上是血管新生的结果。已有研究证实，血管内皮生长因子A(VEGFA)可促进冠状动脉侧支循环的形成，减轻冠状动脉慢性全闭塞患者远端血管的缺血和心绞痛症状，保留患者心室功能[22-23]。本结果显示，急性缺血性脑卒中患者血清miR-330-5p、VEGF水平较健康体检者高，随着患者脑侧支循环分级增加，血清miR-330-5p、VEGF水平逐渐升高，且二者表达呈正相关，提示血清miR-330-5p水平可能参与急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环的形成过程，可能与血管内皮细胞增殖分化有关，具体作用机制尚不清楚。

内皮细胞衰老被认为是血脑屏障完整性受损的主要原因，衰老机制包括内皮细胞功能障碍、动脉硬化和内皮细胞微囊释放[24]。miRNA在细胞衰老、血管内皮损伤中的作用越来越受到关注[25-26]。国内学者报道称，VD患者血清miR-34a表达升高，VEGF水平降低，二者水平呈负相关，可能导致VD患者病情加重[5]，与本研究结果不同。本研究结果显示，急性缺血性脑卒中患者血清miR-34a-5p水平较健康对照组高，随着患者脑侧支循环分级增加，血清miR-34a-5p水平呈逐渐上升趋势，且与VEGF水平呈正相关，与王御林等[5]研究相似，表明miR-34a-5p可能通过协同VEGF，参与急性缺血性脑卒中脑侧支循环形成过程。推测可能的原因是VEGF是一种多向性血管生长因子，可促进急性缺血性脑卒中新生血管生成[27]，脑侧支循环的形成即新毛细血管的形成，刺激血管内皮细胞分泌大量VEGF参与内皮功能调节，加上患者血脑屏障功能受损，VEGF进入血液可被检测到。而VD患者由于病情较为严重，血管修复功能降低，VEGF分泌减少，可作为反映脑血管疾病严重程度的一种生物指标。同时发现血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平均对急性缺血性脑卒中患者三级脑侧支循环的建立有一定的诊断价值，且三者联合诊断效能更高，可能作为预测急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环分级的潜在生物标志物。

综上所述，血清miR-330-5p、miR-34a-5p、VEGF水平随急性缺血性脑卒中患者脑侧支循环分级增加而呈上升趋势，miR-330-5p、miR-34a-5p均与VEGF水平呈正相关，推测血清miR-330-5p、miR-34a-5p可能参与脑血管内皮细胞增殖分化，有利于血管新生，具体作用机制尚待更深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

段毅：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；王坤：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；王军英：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；杨欢欢：进行统计学分析；赵平平：课题设计，论文撰写