骨碎补对东莨菪碱模型小鼠学习记忆能力的影响

王 迪，陈 雪，苏 婷，邢淑荣，张 宁，丁立新*，雷 霞*

(1.佳木斯大学 药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2. 黑龙江中医药大学 佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

学习记忆功能障碍是人类衰老进程中最普遍的中枢神经系统退行性病变引发的症状，目前许多发达国家已进入老龄化社会[1]。现代研究认为认知障碍和学习记忆能力损伤与海马胆碱能神经元退化，乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）合成减少，分解增加，胆碱脂酶（Acetylcholinesterase, AChE）和胆碱乙酰化酶（Choline acetyl transferase, ChAT）活性密切相关[2-4]。经美国FDA 批准的抗阿尔茨海默症药物以AChE 抑制剂为主，“胆碱能假说”仍然处于认知障碍发生机制的主流地位。AChE 抑制剂通过减少ACh 的分解来增强认知功能，但通常会产生诸如恶心、呕吐和腹泻等副作用。目前寻找毒副作用小，且能增强胆碱能神经系统功能的药物对开发改善学习记忆功能障碍新药具有重要意义[5]。

研究发现，植物雌激素通过激动脑源性雌激素受体ERβ 从而增强胆碱能神经系统功能，改善学习记忆功能障碍[6-7]，课题组前期从补肾中药中筛选抗学习记忆障碍药物，发现中药骨碎补能够增强小鼠学习记忆功能。中药骨碎补为经典补肾中药，含有大量植物雌激素成分，具有拟雌激素样作用。那么，骨碎补是否通过激活脑ERβ 改善胆碱能神经系统功能，从而增强学习记忆功能，尚未有明确的结论。本实验观察骨碎补对小鼠海马区雌激素受体α（ERα）、雌激素受体β（ERβ）、卵泡刺激素受体（FSHR）以及黄体生成素受体（LHR）的表达，ACh 含量、ChAT 及AChE 活性，从脑源性雌激素受体角度研究骨碎补对小鼠学习记忆功能障碍的影响，为骨碎补新药开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级昆明雄性小鼠，体质量为（25 ± 2）g，购自长生生物技术股份有限公司，合格证号：SCXK（辽）2019-0001。实验动物按国际实验室动物伦理行为准则“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”实施操作[8]。

1.2 实验药品及试剂

骨碎补购自北京同仁堂药店（哈尔滨总店），经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm的干燥根茎。ACh 试剂盒、AChE 试剂盒、ChAT 试剂盒（批号：A105-1、A024、A079-1）均购于南京建成生物工程研究所；抗脑衰胶囊（KN15112502，石家庄四药有限公司）；盐酸多奈哌齐（S60449，上海源叶生物科技有限公司）；Anti-ERβ（bs-0116R，北京博奥森生物技术有限公司）；ER 阻断剂（ICI182780，TOCRIS 公司）；兔抗ERα 多克隆抗体（8644T，Cell Signaling）。

1.3 方法

1.3.1 分组及给药 昆明小鼠分为空白组、东莨菪碱模型组、抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组、骨碎补+ ICI182780 组。根据2020 年版《中国药典》 （一部）可知骨碎补的用法用量为每日3 ～ 9 g，通过查阅文献及其它补肾中药资料发现骨碎补在不同症状中用量不同，按人临床药量计算最终确定每天灌胃给药0.975 g/kg，同时，抗脑衰胶囊组（585 mg/kg）、盐酸多奈哌齐组（0.65 mg/kg）、骨碎补+ ICI182780 组腹腔注射ICI182780（0.072 mg/kg）后给予骨碎补。空白组给予生理盐水，其余组每天腹腔注射3 mg/kg 东莨菪碱。

1.3.2 骨碎补水煎液提取 骨碎补药材100 g，加水回流提取1.5 h （10 倍），过滤后再次煎煮1 h （8倍），合并浓缩至1 g/mL，即得。

1.3.3 行为学测试 Morris 水迷宫（定位航行、空间探索）分析小鼠学习记忆能力；新物体识别：对熟悉物体和新物体的探究时间分析小鼠记忆能力。

1.3.4 HE 染色观察小鼠海马病理学变化 行为学测试后取海马用福尔马林（10%）固定，石蜡包埋后切片，观察小鼠海马病理学变化。

1.3.5 免疫组化法检测骨碎补对东莨菪碱模型小鼠的影响 取海马放入福尔马林（10%）中固定、石蜡包埋切片，血清封闭，滴加适当比例的一抗、二抗孵育、冲洗。中性树质胶封片，显微镜下观察ERβ、ERα、FSHR、LHR 在小鼠海马中的表达情况。

1.3.6 ELISA 检测东莨菪碱模型小鼠中枢胆碱系统水平 按试剂盒说明书操作（ACh 试剂盒、AChE试剂盒、ChAT 试剂盒）。

1.3.7 统计学方法 用SPSS 18.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 骨碎补对东莨菪碱模型小鼠Morris 水迷宫实验的影响

与空白组相比，模型组小鼠潜伏期延长（P<0.01），穿越平台次数和有效区停留时间减少（P<0.01）；与模型组相比，抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组小鼠潜伏期缩短（P< 0.01），穿越平台次数和有效区停留时间增加（P< 0.01）；与骨碎补组相比，骨碎补+ ICI182780 组小鼠潜伏期延长（P<0.01），穿越平台次数和有效区域停留时间减少（P<0.01），见图1。

图1 各组小鼠Morris 水迷宫实验结果比较（x ± s，n = 15）Fig. 1 Comparison of the results of the morris water maze in each group of mice（x ± s，n = 15）

2.2 骨碎补对东莨菪碱模型小鼠新物体识别实验的影响

与空白组相比，模型组小鼠新物体识别指数减小（P< 0.01）；与模型组相比，抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组小鼠新物体识别指数增加（P<0.01）；与骨碎补相比，骨碎补+ ICI182780 组小鼠新物体识别指数减少（P< 0.01），见图2。

图2 各组小鼠新物体识别实验结果比较（x ± s，n = 15）Fig. 2 Comparison of experimental results of new object recognition in each group of mice（x ± s，n = 15）

2.3 各组小鼠海马区HE 染色观察

空白组小鼠海马区神经元数量多、结构清晰、分布均匀、没有核固缩；模型组小鼠海马区神经元数量少、结构缺失、有核固缩现象；抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组小鼠海马区神经元数量较多、结构较为清晰，没有明显核固缩；骨碎补+ICI182780 组小鼠海马神经元数量少，细胞小，有核固缩，见图3。

图3 各组小鼠海马神经细胞形态（×200）Fig. 3 Morphology of hippocampal nerve cells in each group of mice（×200）

2.4 免疫组化检测小鼠海马中ERβ、ERα、FSHR、LHR 表达情况

与空白组相比，模型组小鼠雌激素受体表达减少（P< 0.01）；与模型组相比，抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组小鼠雌激素受体表达增加（P<0.01）；与骨碎补组相比，骨碎补+ ICI182780 组小鼠雌激素受体表达减少（P< 0.01 或P< 0.05），且小鼠海马中ERβ 的表达高于ERα，见表1、图4-图7。

图4 各组小鼠海马ERβ 表达（200×）Fig. 4 Expression of ERβ in the hippocampus of each group of mice（200×）

图5 各组小鼠海马ERα 表达（200×）Fig. 5 Expression of ERα in the hippocampus of each group of mice（200×）

图6 各组小鼠海马FSHR 表达（200×）Fig. 6 Expression of FSHR in the hippocampus of each group of mice （200×）

图7 各组小鼠海马LHR 表达（200×）Fig. 7 Expression of LHR in the hippocampus of each group of mice （200×）

表1 各组小鼠海马区ERβ、ERα、FSHR、LHR 的表达（OD 值）Tab. 1 Expression of ERβ, ERα, FSHR, LHR in the hippocampus of each group of mice（OD Value )

2.5 海马中ACh 含量和AChE、ChAT 活性

与空白组相比，模型组小鼠海马ACh 含量降低（P< 0.01），AChE 活性升高（P< 0.01），ChAT 的活性降低（P< 0.01）；与模型组相比，抗脑衰胶囊组、盐酸多奈哌齐组、骨碎补组小鼠海马ACh 含量升高（P< 0.01），AChE 活 性 降 低（P< 0.01），ChAT活性升高（P< 0.01）；与骨碎补组相比，骨碎补+ICI182780 组小鼠海马中ACh 含量降低（P< 0.05），AChE 活性升高（P< 0.01），ChAT 活性降低（P<0.05），见图8。

图8 各组小鼠海马中ACh（A）含量及AChE（B）、ChAT（C）活性比较（x ± s，n = 15）Fig. 8 Comparison of ACh (A) content and AChE (B) and ChAT (C)activities in the hippocampus of each group of mice（x ± s，n = 15）

3 讨论

东莨菪碱是胆碱的M 受体阻断剂，拮抗M 受体与乙酰胆碱结合，阻断乙酰胆碱对M 受体的激动作用[9-11]。正常情况下，ACh 被胆碱能神经元所利用，其合成途径和代谢途径关键酶ChAT 和AChE 共同维持脑内ACh 平衡，若脑内AChE 水平升高，ACh、ChAT 水平降低，损伤学习记忆能力[12]。本实验中动物行为学测试结果显示，东莨菪碱模型小鼠Morris 水迷宫测试中潜伏期增加、穿越平台次数及有效区停留时间降低，新物体识别指数减小。HE 染色结果显示模型组小鼠海马区神经元数量减少，细胞缩小。上述结果表明东莨菪碱可诱发小鼠明显的学习记忆障碍。

本实验对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍模型给予骨碎补进行干预，发现骨碎补可提高小鼠海马中ERβ 的表达。临床上常用人工合成的雌激素替代治疗，然而不良反应（如：生殖系统肿瘤、乳腺癌）影响其长期使用。植物雌激素与内源性雌激素结构相似，既能发挥对神经系统的保护作用，又能避免不良反应的发生[13]，其通过海马ERβ 受体发挥作用，对于主要表达于下丘脑的ERα 受体影响较小。研究发现多数植物雌激素对ERβ 的亲和力高于ERα[14]。免疫组化结果显示给予骨碎补后东莨菪碱模型小鼠ERβ的表达高于ERα，而在使用ICI182780 拮抗剂后ERβ的表达少于给药组，说明骨碎补具有一定的雌激素样作用，可特异性地激动ERβ，对海马神经元具有保护作用。

植物雌激素可通过促进神经生长因子（NGF）及其受体的表达，促进ACh 释放，调节胆碱能系统介导认知障碍过程[15]。雌激素与神经细胞核膜上ER结合通过促进基因转录发挥作用。研究表明，ER 与NGF 的受体在胆碱能神经元内有共表达[16-18]。在动物模型中，雌激素影响海马依赖性的学习记忆能力，该作用与海马中ACh 释放增加有关[19]。长期剥夺雌激素会降低海马胆碱能的功能状态，而给予植物雌激素则会增强海马胆碱能的功能状态。本研究发现，给予骨碎补能够提高小鼠海马中ChAT 活性、抑制AChE 活性、增加ACh 含量，而给予ICI182780 拮抗剂后可逆转上述实验结果，表明骨碎补通过调控ER信号通路可改善东莨菪碱模型小鼠胆碱能系统功能。

4 结论

骨碎补改善学习记忆能力机制可能是通过调控东莨菪碱模型小鼠脑源性雌激素ERβ 的表达，激活ER通路，促进ACh、ChAT 合成和抑制AChE 分解，增强海马胆碱能系统功能，从而提高学习记忆功能。骨碎补可作为临床改善学习记忆功能障碍的备选药物。