地肤子总皂苷提取工艺的优化及其对α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

杨务彬

（十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院 药学部，湖北 十堰 442000）

地肤子源自藜科植物地肤Kochia scoparia（L.）Schrad. 的干燥成熟果实，药用资源丰富，用于治疗皮肤瘙痒、眼睛和泌尿道疾病等[1]。地肤子主要含有三萜皂苷类[2]、挥发油[3]、黄酮类[4-5]及多糖类[6]等成分。其中皂苷类具有降血糖[7]、抗癌[8]、抗过敏[9]以及抗菌[10]等多种活性。

地肤子总皂苷是其主要活性部位，多采用大孔树脂富集纯化[11]，但对地肤子总皂苷提取工艺优化报道较少。本研究以地肤子总皂苷得率为指标，采用Box-Behnken 响应面法优化地肤子皂苷的超声提取工艺，并对地肤子总皂苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，为地肤子总皂苷的分离纯化及降糖作用研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

UV-2550 型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；BP211D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-300DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

地肤子药材购自十堰市太和医院药房，经十堰市太和医院叶方副教授鉴定为藜科植物地肤Kochia scoparia（L.）Schrad. 的干燥成熟果实。地肤子皂苷Ic 对照品（批号：111723-201904，纯度≥98%），购自成都植标化纯生物技术有限公司；香草醛（批号：20170310），购自国药集团化学试剂有限公司；阿卡波糖 （批号：C12067892）、α-葡萄糖苷酶（批号：12091896）、对硝基苯-α- D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（批号：C12101893），均购自上海麦克林生化科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

精密称取地肤子皂苷对照品3.6 mg，用70%乙醇定容至10 mL 容量瓶中，得到浓度0.36 mg/mL 的对照品贮备液。分别移取对照品贮备液适量，制成不同浓度的对照品溶液。

2.2 地肤子样品溶液的制备

取地肤子药材粉成碎粉，过80 目筛。准确称取粉末2 g，添加乙醇溶液适量，超声提取，滤过，合并滤液。取一定量的滤液，用相应体积分数的乙醇定容至25 mL，即得。

2.3 总皂苷的测定及标准曲线的绘制

参照文献[12]的方法，进行总皂苷的测定及标准曲线的绘制。结果表明，回归方程：Y= 1.31X+ 0.167（R² = 0.999 3）， 表 示 地 肤 子 皂 苷 在0.036 ～0.216 mg/mL 内具备较好的线性关系。

2.4 地肤子总皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

配制碳酸钠溶液、阿卡波糖溶液、pH 6.8 的磷酸盐缓冲液、α-葡萄糖苷酶溶液以及PNPG 溶液，将最优条件下提取的地肤子总皂苷提取液，用磷酸盐缓冲溶液稀释成浓度在0 ～ 3.5 mg/mL 的样品溶液，以阿卡波糖做对照，并将阿卡波糖稀释成与样品浓度一致的溶液。分别制成样品测定组（加样品溶液与α-葡萄糖苷酶溶液）、样品空白组（不加α-葡萄糖苷酶溶液）、阳性对照组（加阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶溶液）以及阳性空白组（阿卡波糖溶液），参照郑丽婷等[13]的方法进行测定。抑制率计算公式为：

式中：A1为阳性对照组，A2阳性空白组，A3样品测定组，A4样品空白组。

2.5 统计学方法

用SPSS20.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.6 单因素试验及结果分析

2.6.1 乙醇体积分数对地肤子总皂苷得率的影响按“2.2”项下的方法，准确称取地肤子药材7份，各2 g。固定超声提取时间：30 min，液料比：40 mL/g，选用体积分数分别是30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，进行地肤子样品溶液的制备及测定，并计算总皂苷得率，见图1。乙醇体积分数为70%时，地肤子总皂苷得率最高；超过70%时，溶剂极性降低，植物细胞结构发生失水，通透性降低，导致地肤子总皂苷得率下降。因此，选择70%乙醇作为后续条件优化的参数。

图1 乙醇体积分数对地肤子总皂苷得率的影响（n = 6）Fig. 1 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different ethanol concentration（n = 6）

2.6.2 超声时间对地肤子总皂苷得率的影响 按“2.2”项下的方法，准确称取地肤子药材6 份，各2 g。乙醇体积分数为70%，液料比为40 mL/g，分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，进行地肤子样品溶液的制备及测定，并计算总皂苷得率，结果见图2。提取时间增加，地肤子总皂苷的得率升高，提取时间为30 min 时，地肤子总皂苷的得率最大；超声时间过长，可能导致部分皂苷成分降解；且杂质溶出增多，黏度提高，传质过程减慢，降低了地肤子总皂苷的得率。因而选择超声提取时间30 min 作为后续条件优化的参数。

图2 提取时间对地肤子总皂苷得率的影响（n = 6）Fig. 2 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different extraction time（n = 6）

2.6.3 液料比对地肤子总皂苷得率的影响 按“2.2”项下的方法，准确称取地肤子药材6 份，各2 g。乙醇体积分数：70%，超声提取时间：30 min，以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 （mL/g）的液料比，进行地肤子样品溶液的制备及测定，并计算总皂苷得率，结果见图3。当液料比为40 mL/g时，地肤子总皂苷得率最高。这可能是由于液料比较低时，皂苷不能完全溶解于溶剂，导致总皂苷得率不高；但液料比过大时，溶剂的传质阻力增大，导致总皂苷得率下降。因而选择40 mL/g 的液料比作为后续条件优化的参数。

图3 液料比对地肤子总皂苷得率的影响（n = 6）Fig. 3 The extraction rate of total saponins in Kochia scoparia seeds of different liquid-solid ratio （n = 6）

2.7 Box-Behnken 响应面法优化地肤子总皂苷提取工艺及结果分析

2.7.1 Box-Behnken 响应面试验 根据单因素试验结果，以乙醇体积分数、提取时间、液料比为考察因素，地肤子总皂苷得率为指标，利用Box–Behnken设计，优化地肤子总皂苷的提取工艺。因素及水平见表1，设计方案及结果见表2。

表1 试验的因素水平表Tab. 1 The factors and levels of experiment

表2 试验设计及结果（n = 3）Tab. 2 Design and results（n = 3）

2.7.2 回归模型的建立及数据分析 对试验结果进行多元回归分析，得到二次多项回归方程为：Y=7.596 + 0.261 25A+ 0.253 75B+ 0.265C+ 0.197 5AB–0.31AC– 0.04BC– 0.951 75A2- 0.441 75B2- 0.269 25C2（R2= 0.981 7，R2Adj= 0.958 1），表明该模型准确性较高，可用于地肤子总皂苷提取得率的预测分析。

方差分析见表3，回归模型的P= 0.000 1 < 0.01，说明所建立的回归方程模型非常显著；失拟项P=0.642 1 ＞0.05，表明该试验选择的因素合理。乙醇体积分数（P= 0.001 2 < 0.01）、提取时间（P= 0.001 4 <0.01）以及液料比（P= 0.001 1 < 0.01）对地肤子总皂苷得率有影响。其中，AB（P= 0.026 9 < 0.05），AC（P= 0.003 2 < 0.01）、A2（P= 0.000 1 < 0.01）、B2（P= 0.000 4 < 0.01）、C2（P= 0.005 9 < 0.01）。

表3 回归模型的方差分析Tab. 3 Analysis of variance of regression model

2.7.3 响应面分析 各条件对地肤子总皂苷得率影响的相互作用，见图4。乙醇体积分数与提取时间的交互作用曲面陡峭，说明二者的相互作用对地肤子总皂苷得率的影响显著；乙醇体积分数与液料比的交互作用的曲面较陡峭，说明二者的交互作用对地肤子总皂苷得率的影响十分明显；而提取时间与液料比交互作用的曲面平缓，说明二者的交互作用对地肤子总皂苷得率的影响不显著。交互作用的分析结果与回归分析的结果相一致，进一步表明所建立的模型较合适。

2.7.4 提取工艺的验证 按照已建立的回归模型，预测地肤子总皂苷的最优提取工艺：乙醇体积分数为71.027%，提取时间为32.916 min，液料比为44.015 mL/g， 此条件下地肤子总皂苷的预测得率为7.70%。为便于实验操作，微调后提取工艺参数是：乙醇体积分数为71%，提取时间为33 min，液料比为44 mL/g。按照优化后的工艺参数进行三次超声提取，得到地肤子总皂苷的得率分别为7.51%、8.01%和7.56%，平均得率为（7.69 ± 0.28）%，与预测值较为接近。

2.8 地肤子总皂苷对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

地肤子总皂苷提取液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制情况见图5。地肤子总皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用存在浓度依赖性，当地肤子总皂苷提取液浓度在0.1 ～ 3.0 mg/mL 时，随着浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶的抑制率活性逐渐增强；浓度在3.0 ～3.5 mg/mL，抑制率基本不变。表明地肤子总皂苷具备α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图 4 影响地肤子总皂苷得率的响应面图Fig. 4 Response surface to total saponins value in Kochia scoparia seeds

图5 地肤子总皂苷提取液对α-葡萄糖苷酶活性的影响（n = 3）Fig. 5 α-Glucosidase inhibitory activity of total saponins solvents of Kochia scoparia seeds（n = 3）

3 讨论

预试验考察了回流提取、索氏提取以及超声提取对地肤子总皂苷得率的影响。试验发现，回流提取地肤子总皂苷得率较低，可能与回流提取温度高，导致皂苷类成分的分解有关。索氏提取时，总皂苷得率稍低于超声提取，且索氏提取不便于工业化生产，故地肤子总皂苷的提取方法选为超声提取。

单因素实验考查了乙醇体积分数（30% ～90%）、超声时间（10 ～ 60 min）、液料比（10 ∶1 ～60 ∶1 mL/g）对地肤子总皂苷得率的影响，在考查范围内，地肤子总皂苷得率存在先增加后减少的现象。优化的地肤子总皂苷最佳提取工艺：乙醇体积分数为71 %，提取时间为33 min，液料比为44 mL/g。在此工艺下，地肤子总皂苷的得率为（7.69 ± 0.28）%，优于夏玉凤等[14]提取得到的地肤子总皂苷5.76%，表明超声提取具备一定的可行性。

4 结论

本研究采用响应面法与单因素相结合对地肤子总皂苷超声提取工艺进行了优化，所确定的工艺稳定、节约溶剂、能耗较低，是潜在的工业化提取新方法。体外α-葡萄糖苷酶抑制活性实验显示，最优条件下得到的地肤子总皂苷提取液对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性。但本试验只进行了地肤子总皂苷提取液的体外抑制α-葡萄糖苷酶实验，后续还需要进行体内实验及进一步纯化，并进行药效活性成分追踪，明确具体成分，为地肤子制剂的开发及临床合理应用奠定基础。