5 种乌头属药用植物种子的显微鉴别研究

尹碧薇，郭云刚，池秀莲，陈灵丽，李涟漪，程 蒙，李文渊，葛 慧，赵 鑫，崔光红*，李晓琳*

（1.中国中医科学院中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；3.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；4.青海大学 医学院中藏药研究中心，青海 西宁 810001；5.甘肃中医药大学 和政药用植物园，甘肃 临夏 731100）

乌头属Aconitum植物为一年至多年生草本植物，在全世界范围内约有350 种，我国有200 多种[1]，分别属于乌头亚属、牛扁亚属和露蕊乌头亚属。其中，乌头亚属品种最丰富，共147 种，牛扁亚属共19 种，露蕊乌头亚属仅1 种，即露蕊乌头[2]。该属植物在我国有两千多年的药用历史，约有76 种植物可供药用[3]，如川乌和附子来源于乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的母根和子根[4]；关白附来源于黄花乌头Aconitumcoreanum(Levl.) Rapaics 的块根[5]；草乌、制草乌、草乌叶均来源于北乌头Aconitum kusnezoffiiReichb.[6]。它们多具有祛风除湿、温经止痛之功效，广泛用于风寒温痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉止痛等[7]。此外，乌头属植物的花大多为蓝紫色，是重要的观赏花卉[8]。

种子是药材生产的源头，种子的真伪优劣直接关系到药材的质量。乌头属植物种子外观较为相似，易发生种质混杂，而针对该属植物种子外观、显微鉴别特征的研究也极为贫乏。如：CAPPELLETTI 等[9]对欧洲乌头属植物的种子进行了扫描电镜观察，讨论了横膜翅的产生对种子形态性状演化及其生态适应意义。孔航辉等[10]首次对我国乌头属57 个种及5 个变种的种子外观形态进行了扫描电镜观察，探讨了乌头属种子形态的系统学意义。在显微结构研究方面，仅有乌头[11]、铁棒锤和伏毛铁棒锤[12]种子显微鉴别特征的报道。随着乌头类药材市场需求的不断增加，人工驯化及栽培显得日益迫切，而种子的鉴别对于从源头保障乌头类药材质量具有重要意义。为此，本研究考察了乌头属3 个亚属的5 种易混淆药用植物种子的性状特征、微性状特征和显微特征，以期为乌头属种子的鉴别、质量评价及乌头属植物的系统分类研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌头、显柱乌头Aconitum stylosumStapf 种子采自云南省丽江市玉龙县鲁甸乡，乌头种子由中国中医科学院中药资源中心崔光红研究员鉴定；显柱乌头种子由云南省农业科学院高山经济植物研究所杨少华研究员鉴定；铁棒锤AconitumpendulumBusch、高乌头AconitumsinomontanumNakai 种子采自甘肃中医药大学和政药用植物园，由甘肃中医药大学杜弢教授鉴定；露蕊乌头AconitumgymnandrumMaxim.种子采自青海省黄南藏族自治州同仁县，由青海大学医学院杨仕兵副教授鉴定。采集的种子去除杂质后于4 ℃冰箱保存备用。

VHX-6000 型体视显微镜（日本基恩士公司）；Hitachi S-3400 型扫描电镜（日本日立公司）；MICROM HM325 型转轮式切片机（德国赛默飞世尔科技公司）；YD-6L 型生物组织包埋机（浙江金华市益迪医疗设备有限公司）；OLYMPUS BX53 型显微镜（日本奥林巴斯株式会社）等。

乙醇、二甲苯、藏红T 生物染色剂（批号：20170411）、固绿FCF 染色剂（批号：20181221）（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 方法

种子大小采用游标卡尺测量，10 个重复。外观及解剖结构采用体视显微镜观察，对种子的外观性状、颜色、形态及解剖结构等进行记录并拍照。

显微结构研究先采用扫描电镜进行观察：将干燥后的种子用导电双面胶固定在样品台上，干燥、喷金处理后在放大35 倍、200 倍和1 000 倍下，对种子的整体形态、表面附属物形态及表皮纹饰进行观察和拍照。然后再用石蜡切片法进行制片观察：将种子在FAA 固定液中固定15 d，依次用70%、80%、90% 、95%、100%乙醇溶液逐级脱水，每次2 h。无水乙醇-二甲苯（1 ∶1）1 h、二甲苯1 h 浸泡至种子透明。浸蜡时间24 h，切片厚度为10 μm。切好的蜡片在展片仪上展开，并于50 ℃烤干。在二甲苯中脱蜡、梯度复水，番红染色2 h，经系列乙醇逐级脱水后放入固绿溶液中染色，乙醇洗涤后二甲苯透明封片，在显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 性状鉴别

乌头属种子的共同性状特征是倒卵状三棱形，灰褐色至褐色，顶端较宽且平，基部具不明显的种脐；内外种皮膜质，胚乳丰富，乳白色，含油脂，胚细小，鱼雷形，乳黄色，埋生于种仁基部，见图1。

乌头种子长：3.42 ～ 4.53 mm，宽：1.65 ～ 2.61 mm，厚：1.04 ～ 1.52 mm，千粒重：2.35 g；具3 条纵棱，腹棱延伸成较宽的翼状膜质翅；背部具波状横膜翅，两端延伸至两侧面，皱缩，翅上具纵脉纹，见图1：A1-A4。

显柱乌头种子与乌头极为相似，但较大，长：4.20 ～5.79 mm，宽：2.35 ～ 3.34 mm，厚：1.22 ～ 2.06 mm，千粒重：3.40 g；具3 条纵棱，腹棱延伸成翼状膜质翅，背部横膜翅较短，见图1：B1-B4。

铁棒锤种子较乌头和显柱乌头略小，长：2.89 ～3.87 mm，宽：2.03 ～ 2.63 mm，厚：1.24 ～ 1.86 mm，千粒重：1.87 g；3 条纵棱延伸成翼状膜质翅，无皱缩，表面光滑，无明显的横膜翅或横向鳞状翅，见图1：C1-C4。

高乌头种子略小，长：2.42 ～ 3.35 mm，宽：1.91 ～2.29 mm，厚：1.53 ～ 1.89 mm，千粒重：3.29 g；具1 条纵棱，沿棱无翅，背部密生较窄的横向鳞状翅，见图1：D1-D4。

露蕊乌头为露蕊乌头亚属唯一的种，种子显著小于其它乌头属种子，长：1.96 ～ 2.59 mm，宽：1.20 ～1.53 mm，厚：0.70 ～ 1.32 mm，千粒重：1.06 g；表面密生横膜翅，较窄，见图1：E1-E4。

图1 5 种乌头属种子的形态及解剖结构Fig. 1 Microstructures and anatomical structure of 5 Aconitum seeds

2.2 显微鉴别

2.2.1 微性状特征 在放大倍数为35 倍的扫描电镜下观察到乌头种子的翼状翅较宽，横膜翅上具纵脉纹；显柱乌头种子的翼状翅表面具不规则网格状脉纹，横膜翅较窄；铁棒锤种子的表面较平滑，形成长梭形纹理；高乌头种子的鳞状翅较窄，具纵脉纹；露蕊乌头种子的横膜翅较窄，见图2。

图2 5 种乌头属种子翅的扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron microscope images of seed wings of 5 Aconitum seeds

在放大倍数为1 000 倍的扫描电镜下观察到乌头种子的表皮细胞呈长方形，表面具有较多瘤状突起；显柱乌头种子的表皮细胞呈长方形，密生瘤状突起；铁棒锤种子的表皮细胞呈长梭形，表面具有较多瘤状突起；高乌头种子的表皮细胞呈长方形，表面几乎无瘤状突起；露蕊乌头种子的表皮细胞呈梭形或椭圆形，形成网状凹陷，见图3。

图3 5 种乌头属种子表皮纹饰的扫描电镜图Fig. 3 Scanning electron microscope images of seed epidermal ornamentation of 5 Aconitum seeds

2.2.2 切面显微特征 5 种乌头属种子非常相似，均由外种皮、内种皮、胚乳和胚四部分组成。外种皮细胞为一列长方形厚壁细胞，细胞壁四面增厚，外壁最厚，并部分延伸成翅状，外壁表面有乳头状小突起；内种皮为哑铃状支柱细胞；基部有种脐细胞；胚乳为长方形的薄壁细胞，较大，径向排列，靠近中央细胞较小，内含脂肪油滴和糊粉粒；胚细胞较小，多角形，排列紧密，内含脂肪油滴，见图4。

乌头属种子在外种皮结构、内种皮支柱细胞间隙大小、脂肪油滴数目等略有不同，见图4。乌头种子腹棱处外种皮延伸成较宽的翅，背部外种皮延伸成5 ～ 8 个横向膜质翅，内种皮细胞下有一层薄壁细胞；显柱乌头种子外种皮细胞外壁较薄，约为5 μm，有乳头状小突起，腹棱翅略窄，背部横向膜质翅较多；铁棒锤种子3 条纵棱外种皮细胞外壁延伸成翅，其余部分无翅，有乳头状小突起，内种皮的支柱细胞狭长，排列紧密，胚乳和胚细胞中脂肪油滴较多；高乌头种子1 条纵棱无翅，但背面和侧面的外种皮细胞延伸成多个小翅，内种皮支柱细胞间隙较大；露蕊乌头种子外种皮细胞外壁较薄，约为5 μm，密生较小的横膜翅，内外种皮间有1 ～ 2 层狭长的薄壁细胞，内种皮下有一层较小薄壁细胞，顶端为多层。

图4 5 种乌头属种子的显微结构Fig. 4 Seed microstructures of 5 Aconitum seeds

3 讨论

本研究建立了5 种乌头属植物种子的鉴别方法。由于种子形态性状相对稳定，常作为属下划分的重要依据[13-14]，因此，露蕊乌头和高乌头种子很容易与乌头亚属的3 种植物种子鉴别。单种属的露蕊乌头种子不仅显著小于其它乌头属植物种子，而且其表皮细胞性状和内外种皮间的狭长薄壁细胞均可作为其鉴别特征。牛扁亚属的高乌头种子大小和千粒重与乌头亚属的3 种植物种子区别不明显，以种子密生横向鳞状翅，表皮细胞光滑、无瘤状突起为其主要特征。乌头亚属的乌头、显柱乌头和铁棒锤种子共同的特征是均具3 条纵棱，纵棱延伸成翼状膜质翅[10]。但乌头种子的翼状膜质翅较大，显柱乌头种子明显大于乌头种子，背部的横向膜质翅更多，铁棒锤种子3 条纵棱均延伸成翼状膜质翅，无皱缩，表面光滑。在切面显微结构上，发现铁棒锤内种皮的支柱细胞狭长，排列紧密，这一结果丰富了铁棒锤种子形态鉴别特征[12]。

4 结论

5 种乌头属种子的鉴别特征为：乌头种子腹翅宽大，背部横向膜质翅有5 ～ 8 个；显柱乌头种子大，背翅多；铁棒锤种子无明显的横膜翅或横向鳞状翅，内种皮的支柱细胞狭长；高乌头种子密生横向鳞状翅，表皮细胞光滑、无瘤状突起；露蕊乌头种子小，表面密生较窄横膜翅，表皮细胞形成网状凹陷，内外种皮间有薄壁细胞层。上述鉴别特征可为乌头属种子鉴别提供快速、准确的方法，从生产的源头——种源上解决种质混杂问题，有利于药材质量控制，为乌头属植物的人工驯化和繁育提供技术支撑，同时也可为乌头属植物的分类和系统学研究提供依据。