HNRNPU在重度少、弱精子症的表达及其对卵泡浆内单精子显微注射治疗临床结局的影响

梁嘉颖 曾伟宏 张杰 赖有行 黄志承 郑毅春

广东省妇幼保健院1生殖健康与不孕症科，2儿童遗传代谢与内分泌科，3检验科（广州510010）

精子异常是男性不育症的最主要病因，严重少、弱精子症病因及发病机制尚未明确，是男性不育研究的热点。精子数目异常不是一个单独的疾病，而是多种疾病的一种临床表现或结果。致病因素可能包括药物、内分泌、免疫、感染、创伤等，由于重度少、弱精子症的病因复杂，调控精子发生和运动能力的机制仍不明确，因此对此类疾病的治疗尚处于经验性治疗阶段［1］，严重的少、弱精子症需通过卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）治疗获得后代。

蛋白质组学技术可以发现疾病特异性的靶点和标记物，可以提供广泛的诊断及预后信息。近年来，相对和绝对定量的等量异位标签（iTRAQ）多重标记⁃串联质谱技术发展迅速。本研究在前期运用iTRAQ 技术筛选发现HNRNPU 蛋白为严重少、弱精子症组及正常生育组的精子表达差异蛋白质，并且对HNRNPU 蛋白进行初步验证。

在细胞核中，剪接体通用蛋白组件编码基因HNRNPU 主要参与转录和剪接过程。剪接体是真核生物mRNA 前体去内含子转变成熟工具，由5 个亚基（U1、U2、U4、U5 和U6）和150 多种结构蛋白质组成的核糖核蛋白复合物（snRNP）［2］。HNRNPU在维持染色质正常结构中起着核心作用，被认为是凋亡蛋白酶的关键靶点［3］。HNRNPU 缺陷会影响睾丸精原细胞分化，抑制精子发育和成熟［4］，但其相关的病理调控机制和对辅助生殖治疗的预测能力尚不清楚。因此，本研究的目的是探讨HNRNPU 与常规精子质量参数的相关性，及其对ICSI 临床妊娠结局的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象连续收集于2019年1-12月在广东省妇幼保健院行ICSI 治疗的严重少、弱精子症患者和正常孕产妇丈夫的精液标本各500例。诊断标准参照《WHO 人类精液检验与处理实验室手册》（WHO 第5 版）［5］，精子浓度≥15×106/mL，前向运动（PR）精子百分率≥32%，正常形态精子百分率≥4%为正常精子；按照本院生殖中心临床操作规程，ICSI（严重少、弱精子症）组纳入标准：PR精子总数≤5×106/mL。排除标准：染色体核型异常及Y 染色体微缺失等遗传性疾病，全身系统性疾病及先天性疾病，传染性疾病及生殖道感染，睾丸外伤、隐睾等手术史，长期药物或毒性物质接触史等。所有受试者均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会同意。

1.2 试剂珠海贝索生物技术有限公司精子（细胞）形态学快速染色液（Diff⁃Quik 法）；Sigma 公司钙离子载体A23187，异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（FITC⁃PSA）；深圳博锐德生物科技有限公司精子DNA 碎片检测试剂盒（SCD 法）和苯胺蓝染色液试剂盒（核蛋白）；Vitro Life 公司SpermGrad®梯度液、SpermRinse®洗精液；北京百泰克生物技术有限公司TRIpure 总RNA 抽提试剂，Agilent 公司反转录试剂盒及相关软件等。

1.3 主要仪器西班牙Microptic 公司SCA 计算机辅助精液分析系统（CASA）；美国Applied Biosys⁃tems 公司ABI7500 实时PCR 系统；日本Olympus 公司BX53 普通光学显微镜、荧光显微镜。

1.4 方法

1.4.1 精液采集受检者禁欲2 ~ 7 d，手淫采集精液，随即放置37 ℃恒温水浴箱，1 h 内检测。

1.4.2 精液常规按照WHO 第5 版进行精液常规参数检测，采用CASA 系统分析精子浓度和PR%，自动计算PR 精子总数。

1.4.3 精子形态按照WHO 第5 版，采用Diff⁃quik染色法，普通光学显微镜10×100 倍计数200 条精子，计算正常精子形态百分率。

1.4.4 钙离子载体激发顶体反应（ARIC）3~4 mL生理盐水加入1 mL 待测精液，混匀，400 g 离心5 min，弃上清，将沉淀物加到1 mL SpermRinse 底部，上游1 h。取上游后精子加入另一管SpermRinse液中，活动精子调至1×106/mL，孵育3 h 诱导精子获能。获能后精子分为测定和对照管。测定管中加入足量钙离子载体A23187，终浓度为10 μmol/L；对照管中加入等体积DMSO，37 ℃孵育15 min，3%戊二醛终止反应。400 g 离心5 min，弃上清。取沉淀20 ~ 30 μL 移至载玻片上，观察精子密度与活动率等情况后，吸取多余液体，空气干燥。将载玻片浸泡于95%乙醇30 min，空气干燥。迅速加入0.1 mg/mL FITC⁃PSA 40 μL，水平放置4 ℃湿盒内10~12 h。蒸馏水浸泡3 次，每次2 min。荧光显微镜下观察200 条荧光标记染色精子，计算ARIC%。

1.4.5 精子DNA 碎片化指数（DFI）严格按照试剂盒说明书操作。普通光学显微镜10 × 40 倍计数500 条精子，计算大晕环、中晕环（无碎片）和小晕环、无晕环（有碎片）精子的百分率。

1.4.6 精子核成熟度严格按照苯胺蓝染色液说明书操作。普通光学显微镜10 × 100 倍计数200条精子，计算精子核蛋白成份中鱼精蛋白（成熟精子）与组蛋白（不成熟精子）的百分率。

1.4.7 实时定量基因扩增荧光检测系统严格按照TRIzol 试剂说明书提取精子总RNA［6］，使用低起始量快速扩增基因表达标记试剂盒将纯化后的RNA 反转录成cDNA，以此cDNA 为模板在ABI7500实时PCR 系统进行PCR 扩增，以GAPDH 作为内参照，HNRNPU 的引物序列：

F：5⁃TGCCCAACAGAGGGAACTATAACC⁃3

R：5⁃CCTTGGTGATAATGCTGACTCCA⁃3

1.4.8 ICSI 治疗严格按照诊疗规程对严重少、弱精子症患者夫妇进行ICSI 治疗，胚胎移植后第13~15 天若月经未来潮，抽血验β⁃hCG、E2、P4，术后5 周做B 超确认临床妊娠。

1.5 统计学方法应用SPSS 20.0 进行数据处理，计量数据以均数±标准差表示，两两比较采用t检验；相关性采用Spearman 秩相关分析；P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料正常生育组和ICSI 组患者年龄、精液量比较，差异无统计学意义（P> 0.05），两组精子浓度和PR 精子总数（#）比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 两组受试者分组资料比较Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

表1 两组受试者分组资料比较Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

正常生育组ICSI 组t 值P 值例数500 500年龄（岁）32.0±4.1 31.4±3.9 1.004 0.206精液量（mL）2.51±1.01 2.59±0.85 1.478 0.200精子浓度（×106/mL）49.11±22.34 15.82±9.38 7.328 0.001 PR#46.21±7.17 4.50±1.08 9.635<0.001

2.2 正常生育组和ICSI组的精液质量参数比较两组正常形态精子百分率、ARIC%、DFI、精子核成熟度比较差异有统计学意义（P< 0.01），见表2。

表2 两组受试者精液质量参数比较Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

表2 两组受试者精液质量参数比较Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

精子参数正常生育组ICSI 组t 值P 值例数500 500正常形态精子百分率（%）5.01±1.49 2.70±1.81 6.371 0.001 ARIC（%）6.86±1.43 2.42±1.31 6.498 0.001 DFI（%）16.58±3.37 27.30±2.69 5.358 0.002核成熟度（%）70.63±10.18 50.98±10.79 6.384 0.001

2.3 正常生育组和ICSI组的精子HNRNPU mRNA表达水平比较实时荧光定量PCR熔解曲线显示，熔解曲线均为单峰，无引物二聚体或其他杂峰出现，表明扩增特异性良好。HNRNPU mRNA 在正常生育组和ICSI组的相对表达量分别为（0.14±0.03）、（0.38±0.04），差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

图1 正常生育组和ICSI 组的精子HNRNPU mRNA 表达水平Fig.1 Relative expressions of HNRNPU mRNA in the sperm of two groups

2.4 精子HNRNPU mRNA 表达水平与其他精液质量参数的相关性精子HNRNPU 基因mRNA 的相对表达量与PR 精子总数、正常形态精子百分率、诱发顶体反应率和精子核成熟度等均存在负相关（P< 0.01）；与精子碎片化指数存在正相关（P<0.01），见表3。

表3 精子HNRNPU mRNA 表达水平与其他精液质量参数的相关性分析结果Tab.3 Correlation of different semen parameters with HNRNPU mRNA

2.5 精子HNRNPU mRNA 表达水平与ICSI 治疗结局的相关性选择研究时间内，女方采用长效长方案促排卵，并行新鲜胚胎移植的104 个ICSI治疗周期，男方精子HNRNPU 基因mRNA 的相对表达量与PR 精子总数、正常受精（2PN）率存在负相关（P<0.05），与男方年龄、精液量、精子浓度、卵裂率和优质胚胎率无显著相关（P>0.05），见表4。按患者妊娠结局分为临床妊娠组（n= 55）和非妊娠组（n= 49）。HNRNPU mRNA 在临床妊娠组和非妊娠组精子表达量分别为（0.36 ± 0.03）、（0.39±0.06），差异无统计学意义（P>0.05），见表5。

表4 精子HNRNPU mRNA 表达水平与ICSI 治疗结局的相关性分析结果Tab.4 Correlation of ICSI outcome with HNRNPU mRNA

表5 ICSI 临床妊娠组与非妊娠组患者基本情况和各项精液参数比较Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

表5 ICSI 临床妊娠组与非妊娠组患者基本情况和各项精液参数比较Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

妊娠组非妊娠组t值P值例数55 49女方年龄（岁）29.0±1.6 30.3±3.2 0.564 0.773男方年龄（岁）33.5±3.8 32.8±2.7 0.782 0.609不孕年限（年）3.0±0.1 3.1±0.2 0.021 1.247女方BMI（kg/m2）20.91±2.22 20.94±1.30 0.186 0.853获卵数（#）13.31±1.60 12.57±1.33 1.083 0.471 HNRNPU mRNA 0.36±0.03 0.39 ±0.06 0.671 0.715正常形态精子百分率（%）3.01±1.49 2.70±1.81 0.371 0.890 ARIC（%）2.86±1.43 2.42±1.31 1.498 0.225 DFI（%）27.30±9.69 27.58±4.37 1.358 0.337核成熟度（%）50.31±12.28 50.94±10.32 0.062 0.940

3 讨论

据统计，全球范围内不孕不育症患病率约为8%~12%，其中男性因素为主要病因的约50%［7］。男性不育症的病因复杂，主要与影响精子生成的因素有关，如遗传因素、精索静脉曲张和脊髓损伤等；许多不良生活方式也会损害男性生育力，如吸烟、酗酒和肥胖等。近年对不育男性精子的蛋白质组学研究揭示，无精子症和少弱精子症患者的精子中，精囊蛋白Ⅱ前体（semenogelin Ⅱprecursor）和硫酸糖蛋白1（clusterin isoform 1）表达下调，导致精子数量减少、活力受损［8-9］；原发和继发性不育症患者精子中，低表达的蛋白质均与翻译后修饰和折叠有关，如BAG6［10］，表明蛋白质组学分析在不育症男性精子功能评估的重要性。

本研究组前期对不同生精功能的无精子症患者睾丸组织和严重少、弱精子症患者精液精子进行蛋白鉴定和功能分析，经KEGG 数据库注释归类后，与转录后修饰相关的剪接体代谢通路富集，发现剪接体通用蛋白组件编码基因HNRNPU 在正常对照组与病例组的睾丸组织或精液精子之间的表达均存在显著差异，其在生精功能低下的睾丸组织表达显著下调，在严重少、弱精子症患者精液精子表达显著上调，提示剪接体可能参与精原细胞的形成［11］。剪接体是一类调控RNA 之间相互结合并介导前体mRNA 转化为mRNA 的大分子复合体［12-13］。本研究目的为探讨需行ICSI 的严重少、弱精子症患者精液精子中HNRNPU 的表达与精子质量参数的相关性，并探讨其对ICSI 临床结局的影响。

本研究利用RT⁃qPCR 进一步验证了HNRNPU mRNA 在ICSI 组（严重少、弱精子症）精子中相对表达量高于正常组精子（P< 0.001），结果与转录组测序一致，验证了测序结果，提示剪接体蛋白可能通过影响生精细胞的凋亡、死亡和生长而在生精过程中发挥重要作用。由于HNRNPU 在生精功能较差的睾丸组织显著下调，使得mRNA 的转录后修饰第一步即无法进行，HNRNPU 在精子中表达上调可能是由于剪接功能在睾丸组织中受阻后机体代偿的结果。与WU 等［4］的研究相似，其认为剪接体缺陷会影响睾丸精原细胞分化，抑制精子发育和成熟，并与非梗阻性无精子症的发生相关。

研究还将HNRNPU mRNA 和常规精子质量参数进行了相关性分析，结果显示精子HNRNPU mRNA 的相对表达量与PR 精子总数、正常形态精子百分率、诱发顶体反应率和精子核成熟度等均存在负相关，与精子碎片化指数存在正相关（均P< 0.01），提示其可能成为判断精子质量的潜在分子靶标。

选择研究时间内，女方采用长效长方案促排卵并行ICSI 治疗的104 个周期，男方精子HNRNPU基因mRNA 与PR 精子总数和2PN 率存在负相关（P< 0.05），与男方年龄、精液量、精子浓度、卵裂率和优胚率无显著相关（P> 0.05）；同时分析了临床妊娠组和非妊娠组精子HNRNPU mRNA 表达量，差异无统计学意义（P> 0.05）。提示HNRNPU对男性生育力的作用主要是对精子生成和受精能力的影响，可能与本研究女方年龄较小、卵子质量较高、修复精子基因损伤的能力较强有关，说明ICSI 受精后，胚胎发育潜能可能与女方因素关系更大［14-15］。

在精子数< 5 × 106/mL 的不育男性中，遗传异常的发生率是正常男性的10 倍，基因变异不可忽视［16］。精子发生需众多基因协作，多个基因变异可导致生精阻滞［17］。因此，本研究中精子HNRN⁃PU mRNA 表达上调可能是严重少、弱精子症发病的原因之一，对ICSI 受精率有一定的预测作用。在临床工作中，应更多关注男性精子特异基因的变化，其可能影响生育力。