KLF4调控TGF⁃β通路减弱EMT抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭及转移

王宝金 徐丽达 赵欣欣 林少冲 李霞 杜俊鹏 王凯

郑州大学第三附属医院1妇科，4小儿外科（郑州450052）；2河南省卵巢恶性肿瘤国际联合实验室（郑州450052）；3同济大学附属第一妇婴保健院，转化医学研究中心（上海201204）

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅仅次于宫颈癌和子宫内膜癌［1］，病死率居女性生殖系统肿瘤的首位［2］。卵巢癌起病隐匿，术后易复发，缺乏有效的治疗方法［3］。Krüppel样因子4（Kruppel⁃like factor 4，KLF4）是一种参与调控上皮或者间充质基因的含锌指转录因子，可调节细胞生长、增殖和分化等多种细胞过程［4］。KLF4 已被证实在多种癌症中，包括胃癌［5］、乳腺癌［6］、前列腺癌［7］以及骨肉瘤［8］中起着抑癌基因的作用。然而，有研究表明［9］，在小细胞肺癌中KLF4促进癌细胞的增殖和化学抗性。本课题组前期研究表明［10］，在卵巢癌的发生发展中KLF4 扮演着抑制调节剂的作用。然而，其具体分子机制尚未明确。上皮细胞⁃间充质转化（epithelial to mesenchymal cell transition，EMT）能有效地促进肿瘤的生长、耐药性以及肿瘤的增殖。EMT 涉及多种不同的信号通路，TGF⁃β 信号通路为其中之一，且分为Smad 介导及非Smad 介导两条途径，其中最经典的途径是由胞内信号转导蛋白Smad 介导的TGF⁃β 信号转导通路［11］。

目前，在卵巢癌的相关研究中KLF4 的作用及机制尚不明确，本研究通过慢病毒转染建立KLF4过表达的SKOV3 细胞系，旨在探讨KLF4 通过调控Smad 介导的TGF⁃β 通路减弱EMT 从而抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭及转移，并通过建立原位小鼠移植瘤模型，验证KLF4 在卵巢癌发生发展中的作用，为寻找卵巢癌的治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料卵巢癌细胞系SKOV3 购自美国菌种保存中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司。N⁃cadherian 及E⁃cadherian 抗体均购于美国Cell signaling 公司；β⁃catenin、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）及二抗抗体均购于美国Santa Cruz 公司；Western blot 蛋白印迹电泳仪购于美国英杰公司；Western Blot 蛋白印迹转膜仪购于美国伯乐公司；荧光显微镜购于日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及慢病毒转染取对数生长期的

293FT 细胞进行传代培养。将细胞分为KLF4 过表达组和空白对照组，KLF4 过表达组加入包装好的过表达KLF4 病毒，空白对照组加入空载体荧光素酶病毒转染SKOV3 细胞，转染后用嘌呤霉素筛选，将稳定过表达KLF4 的细胞扩大培养，Western blot验证KLF4 的表达。

1.2.2 MTT 实验检测卵巢癌细胞增殖能力的变化实验组为已建立稳定KLF4 过表达的SKOV3细胞系，对照组为荧光素酶载体转染的卵巢癌细胞，取对照组及实验组对数生长期的细胞接种培养。不同时间点分别加入DMSO 试剂，避光孵育后检测各孔的吸光度（波长为570 nm），统计结果并分析后制图。

1.2.3 Transwell 实验检测卵巢癌细胞迁移及侵袭能力的变化取对数生长期的SKOV3 细胞，胰蛋白酶消化并重悬细胞并计数，取1 × 104个SKOV3细胞配置悬液后加入上室。侵袭实验需要制备Transwell 小室内的基底膜：将Matrigel 稀释并加入Transwell小室内基底层。下室均为含10%胎牛血清的DMEM 培养液，温箱孵育细胞5 h 后取出Transwell小室，室温下甲醇固定后结晶紫溶液染色（侵袭实验用HE 染色），置于荧光倒置显微镜下拍照统计，比较细胞迁移、侵袭能力的变化。

1.2.4 Western blot 检测EMT 及TGF⁃β 相关蛋白的表达取合适密度SKOV3 细胞提取细胞蛋白，测吸光光度值（在595 nm 波长下），同时计算各样品的蛋白浓度及所加样品的体积。加热变性后冷却，置于胶孔内，恒压转膜结束后封闭液封闭。孵育抗体后至于暗室曝光。扫描条带，使用Image J对条带进行灰度分析。

1.2.5 建立原位小鼠移植瘤模型验证KLF4 过表达对肿瘤生长、转移的影响将荧光素酶标记的KLF4 过表达SKOV3 细胞和对照组细胞原位注射至裸鼠卵巢包膜内，建立原位小鼠移植瘤模型，通过Xenogen 生物成像系统监测肿瘤的生长和转移情况，每周一次持续8 周。

1.3 统计学方法实验数据采用GraphPad Prism 7统计软件进行分析。对实验数据进行正态检验，服从正态分布的计量资料以均数±标准差表示，比较采用独立样本t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 在SKOV3 细胞中慢病毒载体介导KLF4过表达后细胞增殖能力降低采用MTT 法检测24、48、72、96 h 细胞增殖情况，同一时间点与对照组相比，KLF4 过表达后细胞增殖水平明显降低，差异有统计学意义（P< 0.05），说明KLF4 过表达后明显抑制卵巢癌细胞的增殖。见图1。

图1 MTT 法检测KLF4 过表达组与对照组细胞细胞增殖情况Fig.1 Cell proliferation of KLF4 overexpression group and control group was detected by MTT assay

2.2 在SKOV3 细胞中慢病毒载体介导KLF4 过表达后细胞侵袭、迁移能力降低采用细胞侵袭及迁移实验分别检测KLF4 过表达与对照组细胞的侵袭及迁移能力变化。结果显示：与对照组相比，KLF4 过表达细胞系的细胞侵袭（图2A）及迁移（图2B）能力明显下降，结果有统计学意义（P<0.001），说明KLF4 对卵巢癌细胞的侵袭及迁移能力起到抑制作用。见图2。

图2 KLF4 过表达组与对照组细胞迁移、侵袭能力变化Fig.2 Changes of cell migration and invasion ability between KLF4 overexpression group and control group

2.3 过表达KLF4 抑制卵巢癌细胞SKOV3 EMT相关蛋白的表达Western blot 结果显示：与对照组相比，KLF4 过表达组细胞的EMT 相关间质标志物N⁃cadherin、β⁃catenin 表达降低，上皮标志物E⁃cadherin 表达升高（图3），差异有统计学意义（P< 0.05）。表明过表达KLF4 能够明显抑制卵巢癌细胞的EMT 过程，即KLF4 可能通过抑制EMT过程从而抑制卵巢癌细胞的迁移、侵袭和转移。见图3。

图3 Western blot 检测SKOV3 细胞EMT 相关蛋白的表达Fig.3 Western blot detected the expression of EMT⁃related proteins in SKOV3 cells

2.4 卵巢癌细胞中过表达KLF4 抑制Smad 介导的TGF⁃β 通路Western blot 结果显示，与对照组相比，KLF4 过表达组细胞P⁃Smad2 的表达水平明显降低，差异有统计学意义（P< 0.05），Total⁃Smad 2/3 的表达水平无明显差异。提示KLF4 可能通过抑制Smad 介导的TGF⁃β 通路抑制卵巢癌细胞EMT。见图4。

图4 Western blot 分析比较KLF4 在不同时间点作用的SKOV3 细胞中p⁃SMAD2 及Total⁃SMAD2/3 的表达Fig.4 Western blot analysis and comparison of p⁃Smad2 and Total Smad2/3 expression in SKOV3 cells treated with KLF4 at different time points

2.5 KLF4 抑制原位小鼠卵巢癌移植瘤中原发性肿瘤生长和转移动物成像结果显示，与对照组相比，过表达KLF4组的肿瘤生长及转移显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

图5 KLF4 过表达组与对照组小鼠原位卵巢癌肿瘤生长及转移情况Fig.5 Growth and metastasis of orthotopic ovarian cancer in mice of KLF4 overexpression group and control group

3 讨论

由于卵巢癌起病隐匿，超过75%的女性患者确诊时已为晚期阶段［12］。目前的研究表明，KLF4在不同的癌症中起着不同的生物学作用［5-9］。笔者前期研究结果表明［10］，KLF4 在卵巢癌中起到抑癌基因的作用。本实验通过MTT 及Transwell 实验验证了KLF4 过表达可以抑制卵巢癌的增殖、迁移及侵袭能力这一结论。然而KLF 具体的抑癌机制尚未明确，因此进一步探究KLF4 在卵巢癌中的具体分子作用机制。

EMT 是一个上皮细胞极性和细胞⁃细胞连接缺失，以及迁移和侵入性特性增加的过程，是肿瘤细胞发生迁移、侵袭的基础［13］。近年来大量研究表明，KLF4 在不同的癌细胞中通过激活上皮细胞标记基因E⁃钙黏蛋白（E⁃cadherin）的转录，调节EMT 从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的［14］。同时EMT 参与多种信号通路转导，其中包含TGF⁃β［15］、AKT［16］、Notch［17］、ERK1/2［18］及WNT/连环蛋白［19］等通路。转化生长因子⁃β（TGF⁃β）是一种调节细胞增殖、迁移和分化的细胞因子，通过不同机制在不同细胞类型中触发G1 期细胞周期停滞。在JIANG 等［20］研究中，通过TGF⁃β/Smad2 信号传导途径诱导EMT。基于上述研究，本实验通过慢病毒载体转染建立空白对照组和过表达KLF4 组，进行细胞功能学实验并检测EMT 相关蛋白的表达。

本研究结果表明：与对照组相比，KLF4 过表达的卵巢癌细胞中EMT 相关蛋白发生显著变化；上皮细胞标志物E⁃cadherin 表达增加，间质细胞标志物N⁃钙黏蛋白（N⁃cadherin）、β⁃连环蛋白（β⁃catenin）表达下降。研究表明，在EMT 的整个生物学过程中，伴有上皮标志物E⁃cadherin 表达下调以及N⁃cadherin、β⁃catenin 表达上调［21］，这些变化可导致细胞粘附力降低，极性丧失和紧密连接，从而促进肿瘤的迁移与侵袭。因此，过表达KLF4可通过抑制EMT，从而抑制与EMT 密切相关的卵巢癌细胞迁移侵袭的过程。本实验中的细胞功能学实验结果表明：KLF4 过表达可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。同时，在本实验建立的原位小鼠移植瘤模型中，与对照组相比，过表达KLF4 组的肿瘤生长及转移显著降低，进一步验证了过表达KLF4 可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。这将为卵巢癌的治疗提供新的策略。

综上所述，本研究通过探讨KLF4 在卵巢癌中的作用及其作用机制，证明了KLF4 抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭是通过调控Smad 介导的TGF⁃β通路抑制EMT 实现的。有望成为卵巢癌诊断及治疗的新靶点，为卵巢癌的治疗提供新思路。然而目前的研究仍有不足，例如KLF4 在肿瘤的耐药机制中起到何种作用以及KLF4 的上游基因调控机制等，仍需要进行进一步研究，以期为解决卵巢癌的耐药特性提供新思路、为卵巢癌的治疗提供新的依据。