内含子源性长链非编码RNA SOS1⁃IT1对肝癌细胞的调控

2021-11-18付楠楠刘蕊刘涛

实用医学杂志 2021年19期

付楠楠刘蕊刘涛

1天津市儿童医院（天津大学儿童医院）消化科（天津300134）：2天津市第一中心医院国家卫生健康委员会危重病急救医学重点实验室（天津300192）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）位居全球恶性肿瘤发病率第5 位，死因第3 位。我国每年约34.4 万人死于肝癌，占世界肝癌死亡病例的55%。肝癌常在确诊时已属晚期，且由于其转移率及术后复发率较高，预后较差。我国有1.2 亿乙型肝炎病毒（HBV）携带者，HBV 的慢性感染容易促使肝细胞发生恶性转变［1］，这是我国人群肝癌高发的重要原因之一。肝癌严重威胁我国人民健康，而且为患者带来沉重的经济负担［2］。

肝癌的发生发展是由于一系列癌基因和抑癌基因的突变积累，或者受表观遗传等因素的调控导致癌基因异常高表达和抑癌基因异常低表达所导致的［3］。因此，阐明肝癌发生发展的具体机制，是认识肝癌发生机理的必要过程，也是在分子水平上寻找肝癌早期诊断和治疗方法的关键环节。

长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，ln⁃cRNA）是一类长度大于200 nt 的不具备蛋白编码能力的RNA，广泛参与基因表达调控，与恶性肿瘤的发生和发展密切相关［4-6］。在前期研究中，笔者发现SOS1⁃IT1 是一条来源于基因内含子序列的lncRNA，其可能与肝癌的发生发展相关。本研究通过体外实验证实SOS1⁃IT1 对肝癌细胞恶性表型的促进作用，并探究其作为内含子来源的lncRNA对宿主基因可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂人肝癌细胞系QGY⁃7703购自中国科学院细胞库，在含10%胎牛血清（法国Biowest 公司）的RPMI⁃1640 培养基（北京索莱宝公司）中，置于37 ℃、含5%CO2的恒温培养箱中进行传代培养。pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1（+）/EGFP 和pSilencer 2.1 U6 neo 质粒由本实验室保存。Lipo⁃fectamine 2000 转染试剂购自美国ThermoFisher 公司，CCK⁃8 试剂购自上海东仁（Dojindo）公司，EdU细胞染色试剂盒购自广州锐博公司，分子生物学工具酶（核酸内切酶、连接酶等）购自北京宝日医（TaKaRa）公司，AxyPrep 质粒纯化试剂盒购自美国Corning 公司。DNA 合成由北京奥科鼎盛公司完成，miRNA mimics 合成由上海吉玛公司完成。

1.2 生物信息学miR⁃124 成熟体序列由miRBase数据库（http：//www.mirbase.org/）获取。 lncRNA SOS1⁃IT1全长序列由Ensembl数据库（http：//asia.en⁃sembl.org/index.html）获取。miR⁃124 和SOS1 mRNA的潜在靶定关系通过TargetScanHuman 7.2 数据库（http：//www.targetscan.org/vert_72/）预测。miR⁃124和lncRNA SOS1⁃IT1 的潜在靶定关系通过ENCORI数据库（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测。

1.3 质粒载体构建

1.3.1 SOS1⁃IT1 全长及SOS1⁃IT1⁃MRE 过表达质粒构建将全长1 191 bp 的SOS1⁃IT1 全长序列合成后，克隆插入pcDNA3.1（+）质粒的EcoRI⁃XhoI 位点中，构建SOS1⁃IT1 全长过表达质粒。将SOS1⁃IT1⁃MRE 野生型（wild type，wt）序列或突变型（mu⁃tant，mut）序列（表1）合成后，克隆插入pcDNA3.1（+）质粒的BamHI⁃EcoRI 位点中，构建SOS1⁃IT1⁃MRE 过表达质粒。

表1 SOS1⁃IT1 和SOS1 mRNA 所包含的miR⁃124 潜在结合位点序列Tab.1 Sequence of the potential miR⁃124 response elements within SOS1 mRNA and SOS1⁃IT1

1.3.2 SOS1⁃IT1短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达质粒构建将SOS1⁃IT1 的shRNA 序列（5′⁃GCACTAACCTCGAAGTTAG⁃3′）导入发夹结构的骨架序列中，合成DNA 并克隆插入pSilencer 2.1 U6 neo 质粒的BamHI⁃HindIII 位点中，构建shR⁃SOS1⁃IT1 表达质粒。

1.3.3 荧光报告基因质粒构建将预测的SOS1⁃IT1 或SOS1 mRNA 所包含MRE 的野生型或突变型序列（表1）克隆插入pcDNA3.1（+）/EGFP 质粒中位于EGFP 编码区下游的BamHI⁃EcoRI 位点中，构建荧光报告基因质粒（图1、2）。

图1 SOS1⁃IT1⁃MRE 荧光报告基因质粒结构图示Fig.1 Graphic presentation of the SOS1⁃IT1⁃MRE fluorescent reporter gene plasmids

图2 SOS1⁃MRE 荧光报告基因质粒结构图示Fig.2 Graphic presentation of the SOS1⁃MRE fluorescent reporter gene plasmids

1.3.4 miR⁃124 过表达质粒构建将人基因组中包含miR⁃124 前体的一段190 bp 的序列扩增并克隆插入pcDNA3.1（+）质粒中，并转染细胞，提高细胞内miR⁃124 的水平［7］。

1.3.5 miR⁃124 抑制物表达质粒构建构建miR⁃124 的“强诱饵”（tough decoy，TuD）RNA 表达质粒，并转染细胞，抑制细胞内miR⁃124 的活性［7］。以上所有质粒均经过测序验证，扩增并纯化后用于细胞转染。

1.4 CCK⁃8 细胞活性检测转染后的QGY⁃7703细胞按照5 × 103/孔的密度接种96 孔板，每组设立3 个复孔。次日在各孔细胞中加入CCK⁃8 试剂10 μL，继续培养2 h 后，测定各孔细胞在450 nm 处的吸光度值A450，用以评估细胞活性。

1.5 EdU 细胞DNA 复制活性检测转染后的QGY⁃7703 细胞按照5 × 103/孔的密度接种96 孔板，每组设立3 个复孔。次日，用含50 μmol/L EdU试剂的培养基培养细胞2 h，而后4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X⁃100 通透处理细胞。加入Apollo染色液，对EdU 进行特异性染色，并用Hoechst 染液标记细胞核。在荧光显微镜下观察EdU 染色情况并拍照，应用ImageJ 软件分析各组细胞的荧光强度，用绿色荧光（EdU）/蓝色荧光（Hoechst）的比值，即单位数量细胞的EdU 荧光强度来评估细胞的DNA 复制活性。

1.6 荧光报告基因实验按照实验分组，将荧光报告基因质粒载体和其他质粒或寡核苷酸共转染QGY⁃7703 细胞。次日用RIPA 裂解液裂解细胞提取蛋白，微孔板读数仪检测单位数量细胞内绿色荧光蛋白EGFP 的荧光强度（激发光488 nm，发射光509 nm），评估miRNA 对特定MRE 的作用强度。

1.7 统计学方法应用GraphPad Prism 7 软件进行数据分析。多组间差异比较应用单因素方差分析，组间的进一步两两比较应用Student⁃Newman⁃Keulsq检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOS1⁃IT1 对QGY⁃7703 细胞活性的影响在QGY⁃7703 细胞中，过表达SOS1⁃IT1 后细胞活性增强（P< 0.05），抑制SOS1⁃IT1 后细胞活性降低（P<0.05，表2）。

表2 CCK⁃8 实验检测SOS1⁃IT1 对QGY⁃7703 细胞活性的影响Tab.2 Effect of SOS⁃IT1 on QGY⁃7703 cell viability by CCK⁃8 test ±s

注：与pcDNA3 组相比，*P<0.05；与shR⁃NC 组相比，**P<0.05

组别pcDNA3 pcDNA3/SOS1⁃IT1 shR⁃NC shR⁃SOS1⁃IT1 F 值P 值A450值0.928±0.104 1.184±0.114*0.870±0.091 0.648±0.062**16.23 0.001

2.2 SOS1⁃IT1 对QGY⁃7703 细胞DNA 复制活性的影响在QGY⁃7703 细胞中，过表达SOS1⁃IT1 后细胞DNA 复制活性增强，表现为绿色荧光的相对强度增加（P< 0.05）。抑制SOS1⁃IT1 后细胞DNA复制活性降低（P<0.05，图3、表3）。

表3 EdU 实验检测SOS1⁃IT1 对QGY⁃7703 细胞DNA 复制活性的影响Tab.3 Effect of SOS1⁃IT1 on QGY⁃7703 DNA replication activity by EdU test ±s

注：与pcDNA3 组相比，*P<0.05；与shR⁃NC 组相比，**P<0.05

组别pcDNA3 pcDNA3/SOS1⁃IT1 shR⁃NC shR⁃SOS1⁃IT1 F 值P 值EdU/Hoechst 荧光强度比值0.206±0.016 0.625±0.013*0.271±0.033 0.126±0.022**192<0.001

图3 EdU 实验检测SOS1⁃IT1 对QGY⁃7703 细胞DNA 复制活性的影响（200×）Fig.3 Effect of SOS1⁃IT1 on QGY⁃7703 DNA replication activity by EdU test（200×）

2.3 miR⁃124 直接靶定SOS1 mRNA 和SOS1⁃IT1并调控其表达生物信息学预测发现，SOS1 mRNA的3′非翻译区（3′ untranslated region，3′UTR）包含3 个miR⁃124 的潜在结合位点，SOS1⁃IT1 包含1 个miR⁃124 的潜在结合位点（表1）。

将3 个SOS1⁃MRE 均为野生型序列的荧光报告基因质粒转染细胞后，绿色荧光强度随miR⁃124的水平呈反向变化（P<0.05）。将这3 个结合位点全部突变后，绿色荧光强度不再随miR⁃124 的水平变化而改变（P> 0.05，表4）。进一步将这3 个结合位点中的任意2 个进行突变，发现将第2 和第3 个位点突变，或将第1 和第3 个位点突变后，荧光强度仍随miR⁃124 的水平呈反向变化（P< 0.05）。而将第1 和第2 个位点突变后，荧光强度不再随miR⁃124 的变化发生改变（P>0.05，表4）。提示第1 和第2 个结合位点能够有效结合miR⁃124，而第3 个结合位点不能与miR⁃124 发生有效结合。

表4 EGFP 报告基因实验验证miR⁃124 对SOS1 mRNA 的直接调控Tab.4 Direct regulation of miR⁃124 on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

注：与pcDNA3 组相比，*P<0.05；与pSIH1 组相比，**P<0.05；与pcDNA3 组相比，#P>0.05；与pSIH1 组相比，##P>0.05

组别pcDNA3 pri⁃124 pSIH1 TuD⁃124 F 值P 值EGFP/SOS1⁃MREwt 3.29±0.232 1.53±0.259*3.07±0.107 4.21±0.334**60.62<0.001 EGFP/SOS1⁃MRE1/2/3mut 3.85±0.264 3.59±0.098#3.91±0.131 3.93±0.306##1.615 0.261 EGFP/SOS1⁃MRE2/3mut 3.61±0.288 2.66±0.377*3.54±0.041 5.45±0.433**39.60<0.001 EGFP/SOS1⁃MRE1/3mut 3.94±0.157 2.45±0.181*3.95±0.298 5.60±0.358**72.34<0.001 EGFP/SOS1⁃MRE1/2mut 3.73±0.468 3.58±0.394#4.23±0.271 4.36±0.319##3.108<0.001

类似地，将包含SOS1⁃IT1⁃MRE 的荧光报告基因质粒转染QGY⁃7703 细胞，发现该位点为野生型的荧光报告基因质粒所表达的绿色荧光强度随miR⁃124 呈反向变化（P< 0.05），而突变型载体荧光强度不随miR⁃124 的变化而改变（P> 0.05，表5）。表明该位点为miR⁃124 的有效结合位点。

表5 EGFP 报告基因实验检测miR⁃124 对SOS1⁃IT1 的直接调控Tab.5 Direct regulation of miR⁃124 on SOS1⁃IT1 verified by EGFP fluorescent reporter assay x±s，×104

2.4 SOS1⁃IT1⁃MRE通过结合miR⁃124调控SOS1 mRNA 的表达将含有SOS1⁃MRE 野生型序列的荧光报告基因质粒转染QGY⁃7703 细胞，同时过表达SOS1⁃IT1⁃MRE 的野生型序列，发现绿色荧光强度较对照组增加（P<0.05）。进一步抑制细胞内的miR⁃124 后，荧光强度明显回落（P< 0.05）。若将SOS1⁃IT1⁃MRE改为突变型序列，绿色荧光强度与对照组相比无明显变化（P>0.05，表6）。

将含有SOS1⁃MRE 突变型序列的荧光报告基因质粒转染QGY⁃7703 细胞，同时过表达SOS1⁃IT1⁃MRE 的野生型序列后，荧光强度不再发生改变。进一步抑制miR⁃124 后，荧光强度亦无变化（P>0.05，表6）。

表6 EGFP 报告基因实验检测SOS1⁃IT1⁃MRE 对SOS1 mRNA 表达的调控Tab.6 Regulation of SOS1⁃IT1⁃MRE on SOS1 mRNA verified by EGFP fluorescent reporter assay ±s，×104

注：与第1 组相比，*P<0.05；与第3 组相比，**P<0.05；与第1 组相比，§P>0.05；与第1 组相比，#P>0.05；与第3 组相比，##P>0.05

编号1 2 3 4 5组别pcDNA3 SOS1⁃IT1⁃MREwt SOS1⁃IT1⁃MREwt+pcDNA3 SOS1⁃IT1⁃MREwt+pri⁃124 SOS1⁃IT1⁃MREmut F 值P 值EGFP/SOS1⁃MREwt 2.71±0.180 3.68±0.315*4.04±0.079 1.09±0.143**2.57±0.244§90.92<0.001 EGFP/SOS1⁃MRE1/2/3mut 2.88±0.169 2.66±0.200#2.80±0.170 2.66±0.183##⁃1.062 0.417

3 讨论

对肝癌发生发展分子机制的探究，有助于开发针对肝癌早期诊断的分子标志物，以及有效的治疗药物靶点。本研究主要探究lncRNA 对肝癌发生发展的调控机制。

真核生物基因组中蕴含着大量的非编码序列。在人类基因组中，有超过70%的序列能够被转录生成RNA，但仅2%左右的序列能够编码蛋白［8］。这些无编码蛋白能力的RNA称为非编码RNA（non⁃coding RNA，ncRNA）。ncRNA 具有很多的种类，其中lncRNA 是一类广泛参与基因表达调控、功能较为活跃的ncRNA。lncRNA 的长度可从200 bp 到100 kb，且缺乏编码蛋白的能力。lncRNA 并非先前被认为的那样是“转录噪音”（transcription noise），而是具有活跃的调控功能，参与细胞的多种生理过程，包括对染色质的调控、转录水平和转录后水平的基因表达调控、蛋白功能调控、充当特定大分子的“吸附物”等［9］。目前已证实，lncRNA 与肝癌发生发展之间存在密切的关系［10］。本研究通过体外实验发现，长度为1 191 bp 的lncRNA SOS1⁃IT1 在肝癌细胞中发挥癌基因的功能，能够增强肝癌细胞的活性。基因组DNA 的复制是细胞增殖过程中发生的重要过程，SOS1⁃IT1 能够加速这一过程，这可能是其促癌活性的主要机制之一。

阐明lncRNA 发挥作用的分子机制是其功能研究的重要环节。lncRNA 具有多种作用模式，能够和DNA、RNA 和蛋白发生广泛的相互作用，其作用过程发生在表观遗传学层面、转录水平、转录后水平等多个层次［11］。有一类lncRNA 来源于编码基因的内含子（intron），被称为内含子源性lncRNA（intronic lncRNA）［12］，其命名方式为在编码基因名称后加⁃IT 后缀，IT 即intron 一词的缩写。遗传学研究已证实，真核生物的结构基因为断裂基因（split gene），即编码蛋白的基因序列在基因组DNA中被一些无编码作用的碱基序列分隔开。在转录过程中，首先生成不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA），继而经过剪接加工过程，去除不编码蛋白的序列即内含子，将编码序列（外显子，exon）部分拼接起来，该过程是mRNA 加工成熟的重要环节。既往认为，内含子是mRNA 加工成熟过程中的“废弃物”或“副产物”。但近年来多项研究表明，剪切下来的内含子RNA 能够影响转录起始效率、转录产物输出细胞核、增强转录产物稳定性等，从而在转录后水平上协助宿主基因的表达［13-14］，这些研究否定了先前认为内含子RNA 仅为mRNA 加工成熟过程中“废弃物”的观点。随着研究的深入，发现有些内含子能够发挥与lncRNA 类似的活性，这也为内含子的功能拓展提供了新的方向。本研究所涉及的SOS1⁃IT1 即为一种来源于真核生物内含子的lncRNA 分子，其位于人类SOS1 基因的内含子19 和20 之间，与宿主基因SOS1 一同转录，并随着SOS1 mRNA 的加工成熟过程而生成。探究其在肝癌细胞中发挥癌基因活性的分子机制，是后续研究的重点。

lncRNA 与生物大分子之间存在广泛的相互作用，其与microRNA（miRNA，miR）的相互作用形成了竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制。miRNA 是另一类内源性的ncRNA家族，其成熟体的长度很短，长度约22 nt，经典作用模式是通过与靶RNA（可能是具有编码能力的mRNA 或ncRNA）的3′ UTR 发生不完全互补配对结合，来抑制靶RNA 的翻译或促使其降解，且miRNA 与肿瘤发生发展亦有密切的关系［15］。与正常肝细胞相比，肝癌细胞中的miRNA 表达谱发生明显改变，且参与肝癌的发生发展过程［16］。当不同的两条或几条RNA 分子序列上具有相同的miRNA 结合位点（即miRNA 反应元件，miRNA re⁃action element，MRE）时，这些RNA 分子能够通过竞争性结合细胞内有限的miRNA 来影响各自的表达水平，这种调控模式即为ceRNA［17］。ceRNA 调控模式是细胞内不同RNA（包括编码蛋白的mRNA 和非编码RNA）相互交流（crosstalk）的重要模式之一，ceRNA 调控网络的异常也与肝癌等多种恶性肿瘤的发生密切相关［18］。本研究初步证实，SOS1⁃IT1 与其宿主基因SOS1 的mRNA 均含有miR⁃124的结合位点，SOS1⁃IT1 通过与SOS1 mRNA 竞争性结合miR⁃124 来减轻miR⁃124 对SOS1 表达的抑制，从而正向调控SOS1 的表达，这一结论由以下实验证据支持。一方面，SOS1 mRNA 的3′UTR 含有3 个潜在的miR⁃124 结合位点（MRE），且通过实验证实前2 个位点为功能性的结合位点。SOS1⁃IT1 亦含有1 个能被验证的miR⁃124 的功能性结合位点。这表明SOS1⁃IT1 及其宿主基因的mRNA 含有相同的MRE，这为二者的ceRNA 调控提供了可能。另一方面，在肝癌细胞系中过表达SOS1⁃IT1 上的MRE 序列，能够导致SOS1⁃MRE 上游的荧光报告基因表达增强。这表明SOS1⁃IT1⁃MRE 能够竞争性地吸附更多的内源性miR⁃124，从而减轻SOS1基因被抑制的程度。进一步在细胞中过表达miR⁃124，已增强的荧光强度重新回落，表明过量的miR⁃124 超出了SOS1⁃IT1⁃MRE 的结合能力，SOS1基因的表达重新受到抑制。若过表达突变的SOS1⁃IT1⁃MRE 序列，或改用包含突变型SOS1⁃MRE 序列的荧光报告基因质粒，则无法观察到荧光强度的上述变化。以上结果支持SOS1⁃IT1 及其宿主基因SOS1 之间存在由miR⁃124 介导的ceRNA调控机制。

SOS1基因的全称为SOS Ras/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子1（SOS Ras/Rac guanine nucleotide exchange factor 1），其与鸟嘌呤核苷酸结合，使RAS 蛋白从无活性的GDP 结合体转化为有活性的GTP 结合体，从而调控RAS 基因的功能，这一途径是SOS1发挥癌基因活性的分子机制之一。若阻断RAS 和SOS1 的相互结合，能够减低癌基因RAS 的活性，避免RAS 突变体对GTP 相关信号通路的持续激活，起到抗细胞增殖的作用［19］。SOS1 突变体可能导致RAS 信号途径的过度活化，促进肺癌细胞的增殖［20］。在笔者的前期研究中，通过基因芯片技术检测发现，SOS1 在肝癌细胞中呈明显的上调表达［7］，提示其在肝癌中可能发挥癌基因的活性。本研究主要关注SOS1 基因表达的上游调控机制，一方面发现了其内含子来源的lncRNA SOS1⁃IT1能够促进肝癌细胞的活性和DNA 复制过程，另一方面证实了SOS1⁃IT1 能够以ceRNA 机制正向调控SOS1 的表达。结合SOS1 基因的功能，推测SOS1⁃IT1 能够通过ceRNA 机制辅助宿主基因SOS1 的表达，从而发挥癌基因的活性。这一结论不但为肝癌发生发展的分子机制提供了实验依据，为开发抗肝癌药物提供了可能的靶位点，对基因内含子的功能和可能的作用机制有进一步发现。