脂肪间充质干细胞及普兰尼克F127水凝胶复合物对宫腔粘连子宫内膜的修复作用

祖珍玉 罗敏 申东翔 张科 李军鹏 陈洁 吴琳 申博文

1广州中医药大学（广州510000）；2中国人民解放军南部战区总医院（广州510000）；3中山大学医学院（广州510000）

宫腔粘连是一种以子宫内膜损伤后宫腔前后壁部分或完全粘连为特征的妇科疾病［1］。IUA治疗的主要目的是重建宫腔并恢复子宫内膜功能［2］。宫腔镜下经宫颈粘连切除术（hysteroscopic transcervical resection of adhesion，TCRA）是宫腔粘连治疗的标准方法，但术后粘连的高复发率和子宫内膜容受性下降所致的低妊娠率仍然是临床中重度IUA 患者重点关注的问题［3-5］。

普兰尼克F⁃127（Pluronic F⁃127，PF⁃127）是一种可吸收的生物相容性支架材料，具有包括固有的生物相容性、低抗原性和生物降解性等优异的生物学特性［6］。ADSCs 来源丰富，可通过分离、体外培养获取且具有较强的分化能力［7］。越来越多的证据表明，脂肪间充质干细胞经过反复扩增后功能旺盛，其抗炎抗纤维化作用和低免疫原性能抑制干细胞凋亡并能刺激干细胞再生，可在未来作为IUA 潜在治疗方法［8-9］。目前鲜有将ADSCs和PF⁃127 水凝胶复合物应用于中重度IUA 患者子宫内膜再生修复的研究。本研究通过建立与临床IUA 致病因素相似的化学损伤IUA 模型，并通过构建ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物，探讨其在体内治疗效果及其可能修复作用机制，以期为解决中重度IUA 患者子宫内膜容受性下降的问题提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物普通级健康成年未孕雌性新西兰大白兔65 只，兔龄6～8 周，体质量2.4～2.6 kg，购自广东省医学实验动物中心［实验动物许可证号：［SCXK（粤）2019⁃0023］。兔子宫组织取材和相关实验于南部战区总医院实验动物中心实验室内进行［SYXK（粤）2019⁃0100］，通过动物实验伦理审查（2019102502）。

1.2 主要试剂与仪器免疫组化试剂盒（Sigma，美国）；Masson 染色试剂盒（Sigma，美国）；BX⁃51 显微镜系统及数字图像采集系统（Olympus，日本）；计算机图像分析系统Image⁃ProPlus6.0（SilverSpring，美国）等。

1.3 实验方法

1.3.1 脂肪间充质干细胞负载PF⁃127 水凝胶复合物的制备兔脂肪间充质干细胞的分离、纯化、培养与鉴定按LI 等［10］研究方法，选择25%的PF⁃127凝胶溶液包裹ADSCs 进行细胞封装，制备ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物以备后续实验。

1.3.2 实验分组及模型的制备选用25 只健康雌性普通级新西兰大白兔并将其随机分为假手术组、IUA 模型组、PF⁃127 水凝胶组、ADSCs 组、AD⁃SCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组，每组5 只。假手术组：打开腹腔，暴露双侧子宫，不对子宫作任何处理，关腹；IUA 组：用95%乙醇损伤一侧宫腔30 s，关腹；PF⁃127水凝胶组：建立IUA 模型14 d后，随机选取一侧兔子宫，使用注射器沿该侧子宫角长轴向腔内注入2 mL PF⁃127溶液，静置1~2 min，以确保注入宫腔内的PF⁃127 溶液在生理温度下已经由液态转变为凝胶态；ADSCs 组：建立IUA 模型14 d后，随机选取一侧子宫，使用注射器沿该侧子宫角长轴向腔内注入2 mL ADSCs 悬液（2×106个细胞）；ADSCs⁃PF⁃127 复合物组：建立IUA 模型后，随机选取一侧子宫，使用注射器沿该侧子宫角长轴向腔内注入2 mL ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物；所有组别对侧子宫均不予任何干预治疗。干预治疗术后，给予每组每只新西兰白兔青霉素10 万IU/日，连续腹腔注射3 d。

1.3.3 病理组织切片及染色各组新西兰大白兔在干预治疗14 d 后，开腹取出双侧子宫并分离，然后将分离出的子宫置于4%多聚甲醛浸泡固定后标准石蜡包埋，切成5 μm 切片以备后续苏木精⁃伊红（Hematoxylin and eosin，HE）染色和Masson 染色实验及免疫组化实验。

1.3.4 子宫内膜腺体数量检测兔子宫组织样本的石蜡切片行HE 染色。将染色的切片在室温下风干并用中性树脂固定，然后，用显微镜观察子宫的形态，计算腺体数量，并在每张切片上随机选择至少5 个高倍镜视野图像，计算平均值。

1.3.5 子宫内膜纤维化程度检测兔子宫组织样本的石蜡切片行Masson 染色检测子宫内膜纤维化。应用图像处理软件Image⁃ProPlus 6.0 计算每个视野中子宫内膜间质及腺体总面积的比值，并在每张切片上随机选择至少5 个高倍镜视野图像，计算平均值。

1.3.6 子宫内膜厚度检测兔子宫组织样本的石蜡切片行HE染色和Masson染色。采用图像处理软件Image⁃ProPlus 6.0测量子宫内膜厚度，计算平均值。

1.3.7 免疫组织化学检测兔子宫组织样本的石蜡切片行免疫组织化学染色检测TGF⁃β1的免疫表达量，采用图像处理软件Image⁃ProPlus 6.0 记录每个视野子宫内膜腺上皮和腔内上皮的平均光密度（mean optical density，MOD），并在每张子宫切片上随机选择至少5个高倍镜视野图像，计算平均值。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。符合正态分布和方差齐性的定量资料以均数±标准差表示，各组数据采用单因素方差分析及Tukey 事后多重比较进行分析，以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色评价损伤后子宫内膜腺体数目变化假手术组子宫内膜结构完整，IUA 模型组子宫内膜表面被扁平的低柱状上皮细胞覆盖，子宫内膜萎缩变薄、纤维化，上皮下有少量腺体，间质水肿并伴有宫腔粘连带出现，PF⁃127 水凝胶组和AD⁃SCs 组子宫内膜稍增厚，ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组中腺体出现大量增生。与假手术组相比，IUA模型组子宫内膜腺体数目显著下降（P< 0.05）；ADSCs 组和PF⁃127 水凝胶组子宫内膜腺体数目与IUA 模型组相比差异无统计学意义（P> 0.05）；而ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组子宫内膜腺体数目与IUA 模型组相比明显增加（P<0.05），见图1、表1。

图1 各组兔子宫内膜腺体情况Fig.1 The endometrial glands of rabbits in each group

表1 各组子宫内膜腺体数目的分析比较Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

表1 各组子宫内膜腺体数目的分析比较Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

治疗组别假手术组IUA 模型组PF⁃127 水凝胶组ADSCS 组ADSCs+PF⁃127 水凝胶组例数5 5 5 5 5子宫内膜腺体数目（个/HP）17.50±0.50 1.50±1.50 7.50±0.25 7.50±2.50 16.50±2.50 F 值30.25 P 值0.021

2.2 Masson染色评价损伤后纤维化增生的变化假手术组子宫内膜间质几乎无胶原纤维沉积。IUA 模型组胶原纤维沉积增加，毛细血管充血水肿，间质有大量中性粒细胞浸润，ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组子宫内膜胶原纤维沉积量较IUA 组明显减少。通过检测各组子宫内膜纤维化面积比率结果显示，与假手术组相比，IUA 模型组纤维化面积比率显著增加（P< 0.05）；PF⁃127 水凝胶组子宫内膜纤维化比率与IUA 模型组相比差异无统计学意义（P> 0.05）；ADSCs 组和ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组纤维化面积比率较IUA 模型组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见图2、表2。

表2 各组子宫内膜纤维化面积比的分析比较Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表2 各组子宫内膜纤维化面积比的分析比较Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治疗组别假手术组模型组PF⁃127 水凝胶组ADSCs 组ADSCs+PF⁃127 水凝胶组例数5 5 5 5 5纤维化面积（%）4.20±0.32 59.60±3.68 35.09±4.37 29.45±3.54 4.32±0.57 F 值10.58 P 值0.002

图2 各组兔子宫内膜纤维化情况Fig.2 The fibrosis of endometrium of rabbits in each group

2.3 HE 染色和masson 染色评价损伤后子宫内膜厚度变化在干预治疗14 d 后测定各组兔子宫内膜厚度。结果显示，与假手术组相比，IUA模型组子宫内膜厚度变薄（P< 0.05）；ADSCs 组和PF⁃127水凝胶组子宫内膜厚度与IUA 模型组相比差异无统计学意义（P>0.05）；ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组子宫内膜厚度与IUA 模型组相比明显下降，差异具有统计学意义（P<0.01），见图3、表3。

图3 各组兔子宫内膜厚度情况Fig.3 The endometrial thickness of rabbits in each group

表3 各组子宫内膜厚度分析比较Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表3 各组子宫内膜厚度分析比较Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治疗组别假手术组模型组PF⁃127水凝胶组ADSCs组ADSCs+PF⁃127水凝胶组例数5 5 5 5 5子宫内膜厚度（μm）567.31±30.56 178.67±24.56 265.68±7.45 289.23±12.78 489.46±13.24 F值127.450.014 P值

2.4 免疫组织化学检测为了更进一步量化各组宫腔粘连子宫内膜纤维化程度，在干预治疗14 d后通过免疫组织化学实验检测TGF⁃β的免疫表达量。结果显示，与假手术组相比，IUA模型组TGF⁃β的免疫表达量明显升高（P< 0.05）；ADSCs 组和PF⁃127水凝胶组子宫内膜TGF⁃β 免疫表达很弱，与IUA模型组差异无统计学意义（P>0.05）；而ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组TGF⁃β 免疫表达量显著低于IUA 模型组，差异具有统计学意义（P< 0.001），见图4、表4。

表4 各组兔子宫内膜组织TGF⁃β 免疫表达水平分析比较Tab.4 Comparison of TGF⁃β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

表4 各组兔子宫内膜组织TGF⁃β 免疫表达水平分析比较Tab.4 Comparison of TGF⁃β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

治疗组别假手术组模型组PF⁃127水凝胶组ADSCs组ADSCs+PF⁃127水凝胶组例数5 5 5 5 5 TGFβ⁃1免疫表达量0.01±0.00 0.04±0.01 0.03±0.02 0.02±0.01 0.05±0.02 F值0.21 P值<0.001

3 讨论

宫腔粘连通常伴随着正常子宫内膜的结构破坏，导致月经异常、不孕、反复流产和妊娠并发症［11-14］。医源性刮宫是子宫内膜功能层丢失的主要原因［12］。宫腔镜粘连松解术和激素治疗是去除宫腔内结缔组织，重建子宫内膜的常用方法，但术后粘连高复发率仍然是临床难题［15］。间充质干细胞由于具有丰富的可获得性、自我更新和分化的潜力在再生医学中显示出巨大的应用潜力［14］。PF⁃127 水凝胶可成为细胞运输载体，保证内膜修复过程中干细胞的有效浓度［16-18］。本研究通过构建ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物，比较评价其对化学损伤IUA 兔子宫内膜的修复作用，从而为中重度IUA 的治疗提供新的思路。

注：干预治疗14 d 后行免疫组织化学染色（×400）

在本研究中，经PF⁃127 水凝胶组干预治疗后子宫内膜仍有胶原纤维沉积，仅有少量腺体增生，TGF⁃β 表达量上调，这说明仅用单独PF⁃127 水凝胶治疗不能使子宫内膜腺体大量增生和减轻子宫内膜纤维化；ADSCs 组子宫内膜间质仍有轻度纤维化，腺体数目下降，这说明ADSCs 在减少子宫内膜炎症、增强腺体的增殖方面疗效并不明显。ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物组，宫腔形态基本恢复正常，纤维化程度明显减低，腺体数目明显增加，子宫内膜纤维化标志物TGF⁃β 较IUA 模型组明显降低，这说明其对宫腔粘连子宫内膜纤维化及腺体的增殖均具有一定的改善作用。

综上所述，脂肪间充质干细胞和PF⁃127 水凝胶联合应用于新西兰大白兔IUA 动物模型疗效显著，对其损伤子宫内膜厚度、腺体数量和纤维化程度均有一定的改善作用，ADSCs⁃PF⁃127 水凝胶复合物可以作为一种有效的治疗方法，从而为进一步探讨IUA 的病理机制提供基础。