胡桃醌抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡减轻体外冲击波导致的细胞损伤

田林强 来枫 张玥 王玉华 翁孝刚 董新文 姚三巧 任文杰

新乡医学院第三附属医院1创伤与骨科研究所，2泌尿外科（河南新乡453003）；3新乡医学院公共卫生学院（河南新乡453003）

瓦斯爆炸是煤矿安全生产的常见危害，素有煤矿安全生产“第一杀手”之称，其造成的矿难次数和死亡人数在煤矿安全生产事故中均居首位［1-2］。瓦斯爆炸的主要致伤因素包括爆炸冲击波损伤、高温火焰烧伤和有毒有害气体中毒以及继发灾害［3］。在瓦斯爆炸伤中，肺脏是最易受到损伤的器官［4-5］。笔者前期的研究发现，吸入高温气体和有毒有害气体均会造成肺脏的损伤，并伴随出凝血功能的障碍［6］。在肺损伤及其修复过程中，Ⅱ型肺泡上皮细胞均发挥重要的作用［7］。

研究表明，凝血异常会加重肺内炎症反应，促进和加重肺损伤，而抗凝治疗能够减轻急性肺损伤的发生［8-9］。在颅脑损伤引起的肺损伤中，凝血功能障碍出现在急性肺损伤之前，说明其能够诱导及加重急性肺损伤的发生［10］。笔者前期研究也发现，凝血异常在瓦斯爆炸伤害患者中常见，而且动物实验也证实，瓦斯爆炸伤大鼠肺泡灌洗液中凝血酶⁃抗凝血酶Ⅲ活性明显升高，说明凝血异常的存在［6］。肽基辅氨酰顺反异构酶Pin1 能够调控组织因子的转录和NF⁃κB的活性，进而加重肺组织的损伤［11］。在瓦斯爆炸所导致的肺损伤中，抑制Pin1是否抑制炎症反应或凝血异常，从而改善肺功能，尚未见明确的报道。胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的活性物质，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物学活性［12］。其作为Pin1 的天然抑制剂，能够抑制其促进肿瘤增殖和转移等作用，但其在急性肺损伤中是否发挥作用以及发挥作用的机制尚不清楚。本研究通过建立体外冲击波损伤的A549细胞模型，阐明胡桃醌的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器A549 细胞购自中国科学院上海细胞库，DMEM/F12K 购自上海培源生物科技股份有限公司，胎牛血清、青⁃链霉素双抗、胡桃醌购自Sigma 公司，CCK⁃8 溶液购自碧云天生物技术公司，IL⁃6、IL⁃8ELISA 试剂盒购自联科生物。RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂购自博士德生物科技有限公司、caspase⁃3、caspase⁃9 及β⁃actin 抗体购自Cell Signal Technology。体外冲击波碎石机为交大南洋JDPN⁃V 型，化学发光成像仪为上海勤翔6100 型，全波长读数仪和CO2培养箱购自赛默飞。

1.2 细胞培养及冲击波建模A549 用含10%胎牛血清、1%青⁃链霉素的DMEM/F12K 培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞融合到80% ~90%时，消化传代，取对数生长期细胞用于后续实验。根据文献报道［12］，采用间接定位法确定体外冲击波焦点，将含细胞悬液的离心管固定在涂有螯合剂的焦点处，13.7 kV 固定能量冲击，探索最佳冲击次数。

1.3 细胞增殖活性检测将处理后的细胞以2 000个/孔的密度接种在96 孔板中，在冲击后的24、48、72 h 检测450 nm 处OD值，计算细胞生存率。细胞生存率=（实验组OD值⁃空白组OD值）/（对照组OD值⁃空白组OD值）×100%。

1.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测炎性因子表达收集细胞上清液，300 g离心10 min去除沉淀，取上清，ELISA 试剂盒检测IL⁃6、IL⁃8的含量。按说明书进行操作，测定450 nm 处的OD值。通过标准品浓度计算拟合曲线，根据公式计算检测样本浓度。

1.5 胡桃醌细胞毒性检测及预处理将A549 细胞以5 000 个/孔密度接种在96 孔板中，细胞贴壁后，加入0.25、0.5、1、1.25 μg/mL 胡桃醌，加药3、6、12、24 h 检测细胞活力，获得后续实验的浓度和作用时间。

1.6 Western blot 检测caspase⁃3 和caspase⁃9 蛋白变化弃去培养基，用预冷的PBS 清洗细胞后加入含广谱蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，4 ℃、10 000 g 离心15 min，取上清。测蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸10 min，分装备用。使用80 V 电压在10% SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳至Marker 条带分开，调整电压为120 V，当染料到达凝胶底部停止电泳。300 mA 电流转膜2 h，封闭90 min，一抗4℃孵育过夜。洗膜后，相应二抗室温孵育1 h，再次洗膜后，滴加ECL 发光液，成像。

1.7 统计学方法所有数据均采用SPSS 25.0 进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检测，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外超声波处理导致细胞活性降低和炎症因子表达增加，提示细胞模型制作成功通过不同次数体外冲击波损伤后检测细胞活力，发现其出现明显的变化，见图1。细胞经过1 000 次冲击后培养24 h，细胞活力降至（49.2 ± 3.04）%，48 h 和72 h 有所回升，探究冲击波损伤的机制，因此采用冲击1 000 次、培养24 h 作为后续的实验条件。同时发现体外冲击波冲击1 000 次后细胞上清中IL⁃6 和IL⁃8 的水平分别为（55.6 ± 0.4）pg/mL 和（1 480.3 ± 19.1）pg/mL，均较正常对照组增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

图1 不同次数冲击波损伤后不同时间点A549 细胞活力的改变Fig.1 Cell viability of A549 cells was detected by CCK⁃8 at different time after exposed to various times of shockwaves injury

图2 胡桃醌预处理能够降低经过冲击波处理的A549 细胞上清液中IL⁃6 和IL⁃8 含量Fig.2 Pre⁃treatment with Juglone，the concentration of IL⁃6 and IL⁃8 in the supernatants was decreased after 1 000 times shockwaves injury

2.2 胡桃醌能够改善冲击波导致的细胞活力下降通过细胞毒性实验发现，胡桃醌在0.5 μg/mL浓度作用A549细胞6 h后，对细胞活力没有明显影响，因此采用这一浓度进行后续实验，见图3。A549 细胞经过0.5 μg/mL 的胡桃醌预处理6 h 后，进行冲击波处理，随后检测细胞活力，发现冲击波损伤组（shockwave group，SW）细胞活力为（52.5 ± 0.9）%，胡桃醌预处理组（shockwave+Juglone group，SW+Jug）细胞活力为（70.1±3.1）%，差异有统计学意义（P<0.05），见图4，说明胡桃醌对细胞有保护作用。

图3 不同浓度胡桃醌处理不同时间后A549 细胞活力Fig.3 Cell viability of A549 was detected by CCK⁃8 at different time after exposed to various concentration of Juglone

图4 胡桃醌预处理A549 细胞能够提高体外冲击波损伤后的细胞活力，降低冲击波对细胞的损伤Fig.4 A549 cells were pre⁃treated with 0.5ug/ml Juglone for 6h，then exposed to 1 000 times shockwaves，the cell viability was increased

2.3 胡桃醌能够抑制体外冲击波导致A549 细胞炎症因子释放为了检测胡桃醌对体外冲击波导致的A549 细胞炎症反应的影响，收集体外冲击波损伤后24 h 的细胞上清，检测IL⁃6、IL⁃8 的表达。结果发现，和冲击波损伤组（shock wave group，SW）相比，胡桃醌预处理组（shock wave + Juglone group，SW+Jug）IL⁃6、IL⁃8 的表达量分别为（37.3±1.2）pg/mL 和（1 281.9± 17.3）pg/mL，差异有统计学意义（P<0.05），见图2，说明胡桃醌能够抑制冲击波导致的炎症反应，从而减轻细胞损伤。

2.4 胡桃醌能够抑制caspase⁃3 和caspase⁃9 的表达在体外冲击波导致的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中发现，caspase⁃3 和caspase⁃9 的表达量明显升高，说明也存在细胞凋亡。加入胡桃醌后，其能够抑制caspase⁃3、和caspase⁃9 的表达，说明能够抑制细胞凋亡，从而减轻上皮细胞的损伤，为后期肺功能的恢复提供条件，见图5。

图5 胡桃醌预处理能够降低caspase⁃3 和caspase⁃9 的表达量Fig.5 Caspase⁃3 and caspase⁃9 protein level were decreased by pretreated with julgone and exposed to 1000 times shockwave injury

3 讨论

本研究发现胡桃醌能够减轻冲击波造成的细胞损伤，提高细胞活力，减少IL⁃6 和IL⁃8 的释放，降低caspase⁃3 和caspase⁃9 蛋白表达水平，抑制肺泡上皮细胞凋亡［13］，从而减少冲击波造成的损害，发挥保护作用，有成为临床治疗肺损伤用药的可能。

肺爆震伤的发生机制尚未明确，冲击波在其中发挥重要作用。冲击波对生物体的作用包括峭化⁃撕裂效应、空化⁃内爆效应、空化⁃生化效应和非热效应，产生修复、血管生成和扩张、解痉及镇痛作用［14］。在低能量情况下，冲击波能够促进ARDS大鼠肺内线粒体转移至特定细胞，发挥减轻炎症反应和降低损伤的作用［15］。但高能量的冲击波能够造成肺组织内血液渗漏、炎症反应增加，活性氧簇表达增高和细胞凋亡增加，其中caspase⁃3蛋白和mRNA的表达水平均明显增高［16-17］。炎性小体激活和炎症反应在急性肺损伤中发挥了重要的作用［18］。本研究发现，使用过量的冲击波刺激，会导致肺泡上皮细胞炎性因子表达升高，caspase⁃3和caspase⁃9蛋白表达升高，发生细胞凋亡。

Pin1 在炎症反应和肿瘤发生中均发挥重要作用［19］，在小肠缺血⁃再灌注损伤中，抑制Pin1 能够抑制炎症反应，减轻损伤［20］。胡桃醌作为Pin1 的天然抑制剂，具有抗炎、抗菌及抗肿瘤生物学活性。胡桃醌在浓度低于10 μmol/L 时对单核巨噬细胞没有明显毒性作用［21］。本研究采用的浓度低于此浓度，发现其作用6 h 对A549 细胞没有明显的损伤。胡桃醌能够抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎性小体的激活，从而抑制炎症反应的发生，发挥抗炎的作用［21］。这和本研究结果相一致。

虽然本研究发现胡桃醌能够抑制冲击波造成的A549 细胞损伤，但是仅进行了体外细胞的实验，没有在冲击波肺损伤动物体内进行验证，而且对损伤的机制研究也不够深入，这是本研究的不足，也是下一步要研究的内容。