外泌体源性miR⁃939靶向ADCY6调控缺氧诱导的心肌细胞损伤

钟育武 赵展庆

海南西部中心医院1急诊科，2重症医学科（海南儋州571700）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因冠状动脉不稳定、血栓形成、心肌坏死而引起的严重心肌急性持续性缺血缺氧［1］。外泌体（exosome，exo）是由细胞分泌到胞外的直径为30~200 nm的小囊泡，该囊泡中含有多种蛋白质与核酸，作为媒介参与细胞之间的信号传递［2］。exo 近些年来被认为是极具潜力的生物诊断标志物，被应用于多种疾病的诊断与治疗中［3］。先前研究表明心肌结节病与AMI 患者循环exo 中miR⁃NA 的表达具有差异，提示exo 源性miRNA 可作为疾病的生物标志物［4］。有研究发现血清exo 分泌miR⁃939⁃5p 在心肌缺血中参与调控血管生成［5］，miR⁃939⁃5p 在AMI 中的表达较健康对照组显著降低［6］，但是miR⁃939 在AMI 中发挥作用的具体机制未被揭示。腺苷酸环化酶6（ADCY6）是一种磷酸酶，主要分布于细胞质膜、细胞核膜、内质网膜上，可将ATP转变成为cAMP，引起细胞的信号应答［7-8］。据报道，肾上腺素通过转录因子CREB1 上调心脏中CIRC⁃HIPK3 进而增加ADCY6 的表达，下调ADCY6 可以减轻小鼠心肌梗死后的心肌纤维化，并维持心功能［9］。

本研究通过建立缺氧诱导的心肌细胞模型与AMI 大鼠模型，分离正常心肌细胞exo，干预exo 中miR⁃939 表达，对AMI 细胞模型与大鼠模型进行exo 治疗，探讨exo 源性miR⁃939 在AMI 中的具体作用机制，为AMI 的诊断与治疗寻找潜在的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 试剂与器材H9C2 细胞（中国科学院上海生物科学研究所细胞库）。HEK293 细胞（湖南丰晖生物科技有限公司）。SD 大鼠（江苏艾菱菲生物科技有限公司）。血清外泌体提取试剂盒（北京全式金生物）。细胞外泌体提取试剂盒（武汉华美生物）。二氯化钴（Sigma⁃Aldrich）。MTT 检测试剂盒（上海翊圣）。Lipofectamine 3000 转染试剂、PVDF膜、RPMI⁃1640 培养基、cDNA 合成试剂盒、Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 仪、化学增强发光试剂、双荧光素酶检测试剂盒（Thermo Fisher）。pcD⁃NA 质粒与miRNA 模拟体、抑制剂（上海吉玛基因）。qRT⁃PCR 引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。放射免疫沉淀裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、TTC 染色液（南京森贝伽生物）。抗体均购自Abcam公司。结晶紫、Annexin V⁃FITC/PI 凋亡检测试剂盒（北京索莱宝）。外泌体转染试剂（上海觅拓生物）。FV3000 激光共聚焦显微镜（Copyright）。CytoFLEX 流式细胞仪（Beck⁃man Coulter）。Vevo 2100 超声机（VisualSonics）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析基因表达数据库（GEO）中搜索关于AMI芯片并进行分析。TargetScan（http：//targetscan.org/vert_72/）获取miR⁃939 的靶基因。

1.2.2 血清收集收集2019年8月至2020年8月我院收治的52 例AMI 患者的血浆（男32 例，女20 例，平均年龄49.5 岁），健康人的血浆从体检人群中进行收集，取材前均签署书面知情同意书。将血浆3 000×g离心30 min，得到血清。本研究经海南西部中心医院伦理委员会批准。

1.2.3 外泌体分离与鉴定血清中外泌体使用血清外泌体提取试剂盒分离并纯化。细胞中外泌体的提取则使用CUSABIO 外泌体提取试剂盒来完成，具体步骤依据试剂盒说明书进行。透射电子显微镜观察外泌体，Western blot 检测exo 标志物CD9、CD81、CD63。

1.2.4 缺氧细胞模型的建立与分组H9C2 细胞接种于96 孔培养板，1.5×104个/孔，添加10%胎牛血清的DMEM 培养基进行培养，加入二氯化钴（CoCl2）用于建立缺氧心肌细胞模型。H9C2细胞被分为8 组：Control 组（常氧H9C2 细胞）、hypoxic 组（CoCl2处理的H9C2细胞）、exo组（CoCl2⁃H9C2+exo）、exo+NC 组（CoCl2⁃H9C2+exo⁃NC）、exo+inh⁃miR⁃939组（CoCl2⁃H9C2+exo+inh⁃miR⁃939）、exo+miR⁃939 组（CoCl2⁃H9C2+ exo+miR⁃939）、exo+miR⁃939+pcDNA组（CoCl2⁃H9C2+exo+miR⁃939+pcDNA）、exo+miR⁃939+ADCY6 组（CoCl2⁃H9C2+exo+miR⁃939+AD⁃CY6）。在转染前1 天将H9C2 细胞接种于6 孔培养板中，每孔5 × 104个，第二天使用Lipofectamine 3000 转染试剂进行转染，24 h 后进行下一步实验。

1.2.5 exo 与H9C2 细胞的共培养H9C2 细胞缺氧培养4 h 后，与正常H9C2 细胞共培养，未进行共培养的缺氧H9C2 细胞作为对照组。使用qRT⁃PCR 检测miR⁃939 的表达情况。

1.2.6 3⁃（4，5⁃二甲基噻唑⁃2⁃基）⁃2，5⁃二苯基四唑溴化铵（MTT）法将细胞制成单个细胞悬液，接种于96 孔培养板，5 × 103个/孔，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h 后向孔板中加入MTT 工作液，每孔10 μL，放置在培养箱中4 h。加入甲臜溶解液，100 μL/孔。培养4 h 后使用酶标仪测定光密度值。

1.2.7 蛋白质印迹分析（Western blot）细胞与exo使用放射免疫沉淀裂解液进行裂解，吸取上清液使用BCA 蛋白定量试剂盒定量。行SDS⁃PAGE 凝胶电泳，在90 mA 时将蛋白转移到PVDF 膜上。5%脱脂牛乳将膜封闭，在膜上加入一抗CD9（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、CD63（1∶1 000）、GM130（1∶1 000）、ADCY6（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下过夜孵育。第二天使用辣根过氧化物酶偶联的二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）室温下孵育1 h。使用化学增强发光试剂显影，并在Bio⁃Rad 数字图像系统上对蛋白进行分析。

1.2.8 Transwell 分析胰蛋白酶处理细胞，并悬浮于RPMI⁃1640 培养基中，调整为3 × 105个/mL，在上腔室加入200 μL细胞，下腔室加入含有20%胎牛血清的600 μL 培养基，放于培养箱中培养24 h。使用棉签擦拭细胞。PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色8 min，在显微镜下拍照观察细胞并对迁移细胞进行计数。

1.2.9 流式细胞术收集细胞并根据Annexin V⁃FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书的要求对细胞进行染色，借助流式细胞仪检测观察细胞凋亡情况，并计算细胞凋亡率。

1.2.10 双荧光素酶报告基因分析构建含有miR⁃939 结合序列的ADCY6 野生型（ADCY6⁃WT）与突变型（ADCY6⁃MUT）质粒，将以上质粒分别与miR⁃939 NC、miR⁃939 mimic 共转染到HEK293 细胞中，按照Lipofectamine 3000 转染试剂的出厂商要求进行转染，48 h 后收集细胞进行裂解，应用双荧光素酶检测试剂盒检测每组细胞的荧光素酶活性，检测过程按照试剂盒要求进行。

1.2.11 qRT⁃PCR将细胞样本中的总RNA 使用Trizol 试剂进行提取，并测定RNA 的浓度与纯度。利用反转录试剂盒将RNA 合成cDNA，mRNA 的表达使用SYBR⁃PCR 混合试剂与Applied Biosystems实时荧光定量PCR 仪进行分析，以上所有检测步骤均按照试剂盒说明书进行。miR⁃939 以U6 作为参考，ADCY6 以GAPDH 为参考。2⁃ΔΔCT法计算相对表达量。

1.3 统计学方法本研究应用SPSS 22.0 软件进行数据分析，数据使用均数±标准差表示。数据是否属于正态分布应用Kolmogorov Smirnov 检验，两组间数据采用t检验进行比较，多组间数据采用单因素方差分析进行比较，两两数据比较采用Sidak 检验或Tukey 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃939 在AMI 样本中表达降低GSE34571数据集显示与未接受治疗降低患者相比，miR⁃939在治疗后的患者中表达显著降低。qRT⁃PCR 实验发现与健康人血清相比，AMI 患者血清中miR⁃939表达降低（图1A，P< 0.05）。与正常H9C2 细胞相比，缺氧H9C2 细胞中miR⁃939 表达降低（图1B，P< 0.05）。另外发现较健康人血清外泌体，AMI患者血清外泌体中miR⁃939 表达显著降低（图1C，P< 0.05）。说明miR⁃939 可能在AMI 的发展中发挥作用。

图1 miR⁃939 在AMI 样本中表达降低Fig.1 The expression of miR⁃939 was decreased in AMI samples

2.2 exo可携带miR⁃939进入H9C2细胞使用透射电子显微镜观察exo 显示为杯状或球行状，直径在40 ~ 100 nm（图2A）。Western blot 实验发现CD9、CD81、CD63 过表达，而GM130 不表达（图2B），exo被成功提取。正常H9C2 细胞与缺氧H9C2 细胞共培养后，缺氧H9C2 细胞中miR⁃939 表达显著上升，而加入外泌体抑制剂GW4869 后miR⁃939 的表达部分降低（均P<0.05，图2C），说明miR⁃939可能由正常H9C2细胞分泌exo包裹进入缺氧H9C2细胞。

图2 exo 携带miR⁃939 进入H9C2 细胞Fig.2 Exo carries miR⁃939 into H9C2 cells

2.3 正常H9C2细胞分泌的exo携带miR⁃939可减轻缺氧心肌细胞损伤与Control 组相比，hypoxic组细胞活力与迁移均降低，凋亡率上升（均P<0.05）。与hypoxic组相比，exo组H9C2细胞的活力与迁移均增加，而细胞凋亡率降低（均P<0.05）。与exo+NC组相比，exo+inh⁃miR⁃939 组的H9C2 细胞的活力与迁移均减少，并且细胞凋亡率上升（均P<0.05，图3）。

图3 miR⁃939 可减轻缺氧心肌细胞损伤Fig.3 miR⁃939 reduced hypoxic cardiomyocyte damage

2.4 miR⁃939和ADCY6存在靶向关系借助Target Scan 预测和miR⁃939 特异性结合位点的靶点，结果显示ADCY6 和miR⁃939 存在特异性结合位点，双荧光素酶报告实验进一步验证了二者间的靶向关系（图4A）。检测正常和AMI患者血清中ADCY6的表达结果显示，AMI 患者血清中ADCY6 的表达显著增强（图4B）。与正常H9C2 细胞相比，缺氧的H9C2 细胞中ADCY6 的mRNA 与蛋白表达均提高（均P<0.05，图4C）。

图4 ADCY6 是miR⁃939 的一个靶点Fig.4 ADCY6 was a target gene of miR⁃939

2.5 ADCY6 可部分抵消miR⁃939 对缺氧心肌细胞的保护作用与hypoxic 组相比，exo 组的细胞活力与迁移均上升，凋亡率下降，而与exo⁃NC 组相比，exo+miR⁃939 组的细胞活力与迁移均有所提高，凋亡率下降，与exo+miR⁃939+pcDNA 组相比，exo+miR⁃939+ADCY6 组中细胞的活力与迁移均下降，而细胞凋亡率有所上升（均P<0.05，图5）。

图5 ADCY6 可部分抵消miR⁃939 对缺氧心肌细胞的保护作用Fig.5 The protective effect of miR⁃939 on hypoxic cardiomyocytes was partially offset by ADCY6

3 讨论

多项研究发现miRNA 可由exo 包裹携带进入细胞发挥功能，而exo 中存在的miRNA 与血液中存在的miRNA 的表达具有差异，所以有必要对exo中的miRNA 进行研究［10⁃12］。本研究通过一系列实验研究exo 及分泌的miR⁃939 在AMI 中的潜在作用机制。

首先分析GEO 数据库中名为GSE34571 的芯片。该芯片显示AMI 患者接受治疗后的心室舒张末期容积（LVEDV）显著低于治疗前［13］，该芯片数据显示miR⁃939 在治疗后的患者中表达显著升高，之前有研究证明miR⁃939⁃5p 在AMI 患者中显著下调［6］，本研究证实miR⁃939在AMI患者中表达较健康人下调。有研究发现miR⁃939可来源于血清exo［14］，本研究分离血清exo，发现在AMI 患者的血清外泌体中miR⁃939 表达显著降低。为进一步确认miR⁃939 外泌体来源的细胞，本研究在正常心肌细胞中分离外泌体，与缺氧心肌细胞共培养发现缺氧心肌细胞中miR⁃939 的表达上调，GW4869 能部分抑制该作用，进一步证实正常心肌细胞分泌的外泌体作为传递miR⁃939 的介质。

另外本研究发现exo 对缺氧心肌细胞具有保护作用，敲减exo 中miR⁃939 的表达可以降低exo对缺氧心肌细胞的保护作用，说明exo 可能是通过分泌miR⁃939 来发挥作用。据报道LncRNA Rp4 可通过下调miR⁃939 加重缺氧心肌细胞的损伤［15］。血清exo 通过miR⁃939⁃iNOS⁃NO 途径促进心肌缺血患者的血管形成。而本研究针对miR⁃939 对缺氧心肌细胞的功能进行探讨。研究显示exo 可以促进心肌细胞的增殖、迁移，并抑制细胞凋亡，对缺氧心肌细胞起到保护作用，并且在exo 中过表达miR⁃939 比单独使用exo 的治疗效果更显著。而敲减exo 中miR⁃939 的表达使exo 对缺氧心肌细胞的保护作用大打折扣，进一步证实exo 是通过分泌miR⁃939 发挥心肌保护作用。此外，本研究证实miR⁃939 可以靶向ADCY6，过表达ADCY6 可部分抵消过表达miR⁃939 对缺氧心肌细胞的保护作用，有研究显示敲除CircSLc8a1 可通过miR⁃133a 下调ADCY6 来减轻压力超负荷所致的心肌肥厚［16］。YANG 等［17］通过PPI 网络分析在心肌细胞中发现6 个与心脏病相关的新基因其中就包括ADCY6。miR⁃182 通过降低ADCY6 的表达来调节心肌肥厚小鼠的心肌肥大反应［18］。在体内exo 可以提高AMI大鼠的LVEF 和LVFS，并减少心肌梗死面积。而在AMI 大鼠中转染敲减miR⁃939 的exo 后，exo 的治疗作用被部分抑制。

本次研究仅仅观察对心肌细胞产生的作用，AMI 的发病过程中仍有其他细胞在参与，如内皮细胞。所以还需要大量研究进一步验证本次研究结果并在临床中实现利用价值。

综上所述，证实exo 分泌的miR⁃939 可以通过下调ADCY6 减轻缺氧心肌细胞的损伤，保护AMI的心肌功能，为AMI 的预防与治疗提供了新的分子靶点。