牛蒡根提取物抗肺癌活性部位筛选

苗 航，张瑜倪，刘冬雪，郭素华，林珠灿

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

牛蒡根为菊科牛蒡属植物牛蒡（Arctium lappa L）的根，又名东洋参，为药食两用性植物，其味辛、苦，性寒，归肺、胃经，具有清热解毒、疏散风热、宣肺祛痰、利咽透疹之功，主治外感风热、咳嗽气喘、咽喉肿痛等症［1］。 该植物在山东、江苏、河南、福建、台湾等地均有分布，尤其在福建省有丰富的生药资源及良好的用药基础。 据记载，牛蒡根中主要含有氨基酸类、糖类、多酚类（咖啡酸、绿原酸等）、黄酮类、炔类和挥发油类等活性成分［2］。 现代药理研究显示：牛蒡根具有抗菌、抗突变、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、降血糖、降血脂和免疫调节等活性［3］。 但是目前关于牛蒡根提取物抗肿瘤活性部位的研究尚未见报道，这极大地限制了牛蒡根药用价值的深入开发与临床应用。 故本实验以IC50值为评价指标，筛选牛蒡根抗肿瘤活性部位，并以肺癌A549 细胞构建皮下移植瘤裸鼠模型，通过测定肿瘤体积、瘤体质量等进一步观察牛蒡根活性部位抗肺癌的作用，以期为牛蒡根防治肿瘤的临床应用及产品研发提供实验数据支撑。

1 实验材料

1.1 实验细胞 肺癌A549 细胞均购自汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 实验动物 30 只清洁级雄性昆明小鼠，体质量（20±2）g，35 只雄性BALB／c 裸鼠，体质量（20±2）g，均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，在福建中医药大学医学实验动物中心SPF 级实验室饲养1 周后开始试验，合格证号：SYXK（闽）2019-0007。

1.3 实验药材 牛蒡根产自台湾省台南县永康市（福建康力得力食品有限公司，批号：20190718），经福建中医药大学药学院中药资源与开发教研室车苏容老师鉴定为菊科植物牛蒡根制成的干燥茶丝。

1.4 实验试剂 RPMI 1640 培养基（美国HyClone公司）；噻唑蓝（MTT，美国Amresco 公司，批号：0793）；顺铂（ 上海源叶生物技术有限公司， 批号：B1210L79601）；石油醚（批号：F20150712）、正丁醇（批号：20150706）、三氯甲烷（批号：20170904）均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.5 实验仪器 恒温CO2培养箱（瑞轩电子科技上海有限公司，型号：Galaxy 170R）；多功能酶标仪（奥地利Tecan 公司，型号：Infinite200 PRO）；－80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher 公司，型号：HFU586）；高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业医疗设备有限公司，型号：YXQ-LS-75SIII）。

2 实验方法

2.1 实验药物 制备称取牛蒡根茶丝250 g，按照料液比1∶6，加入1 500 mL 石油醚（沸点为30～60 ℃），浸泡过夜，60 ℃水浴加热回流提取2 次，每次2 h；合并提取液，过滤，低温减压回收溶剂至干，得石油醚部位。 提取后所剩药渣再加入乙酸乙酯溶液，制备方法同石油醚部位，得乙酸乙酯部位。 收集经石油醚及乙酸乙酯提取后的药渣，加入8 倍量的水，100 ℃煎煮提取2 次，每次90 min；合并煎煮液，减压过滤后浓缩至原提取液体积的1／5，用玻璃棒边搅拌边缓慢加入95%乙醇，用酒精计测定含醇量达70%后保鲜膜封口，将其置于4 ℃冰箱静置12 h；取出后以4 000 r／min 离心10 min，弃上清，将沉淀物放置60 ℃烘箱中干燥，即得含有多糖成分的粗提物；将所得粗提物加蒸馏水溶解制成浓度为50 mg／mL 粗提液，加入粗提液总量1／3 体积的sevage 溶液（三氯甲烷∶正丁醇＝4∶1）充分震荡后用分液漏斗分离，共萃取8 次，上清液冻干后即为多糖。

2.2 肺癌A549 细胞体外增殖检测 取对数生长期的肺癌A549 细胞，用完全培养基将细胞配成适宜浓度的单细胞悬液，调整细胞数1×105个／mL 反复吹打均匀后，以100 μL／孔的体积沿96 孔板孔壁加入，将孔板置于37 ℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养。 待各孔中细胞完全贴壁后给药，设置对照组、顺铂组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、多糖组。 顺铂组浓度为1、5、10、20、40 μg／mL，石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、多糖组浓度为50、200、400、600、800 μg／mL，每个浓度设5 个复孔，每孔150 μL，继续在37 ℃、5% CO2条件下分别培养24、48、72 h 后，吸弃培养基，每孔加入5 mg／mL MTT溶液10 μL，置于培养箱内再孵育4 h，终止培养，加入100 μL／孔DMSO 溶液以溶解结晶紫晶体，在490 nm 处用酶标仪测定每孔的OD 值。重复试验3 次，取其均值计算细胞抑制率，并使用SPSS 25.0软件计算半数抑制浓度IC50值。

2.2.1 牛蒡根各提取部位对肺癌A549 细胞增殖抑制的作用 MTT 法检测不同浓度的牛蒡根提取物在24、48、72 h 的作用时间下对肺癌A549 细胞增殖抑制作用的影响。 由图1 可知：石油醚部位对A549细胞表现出明显的增殖抑制作用。 石油醚部位浓度在0～600 μg／mL 时，对肺癌A549 细胞的增殖抑制作用随着时间和浓度的增加而逐步增强，具有时间和剂量依赖性；当石油醚部位浓度大于600 μg／mL时，其抑制率趋于平缓甚至下降。 此外，当石油醚部位浓度为600～800 μg／mL 时，其24、48、72 h 抑制率均大于80%。

图1 不同浓度及牛蒡根提取部位对A549 细胞的抑制率比较

2.2.2 各组对肺癌A549 细胞不同作用时间点的IC50值比较 通过SPSS 25.0 软件计算IC50值可知：牛蒡根各提取部位中仅石油醚部位对肺癌A549 细胞表现出明显的抗肿瘤活性，阳性药顺铂各时间点的IC50值均显著低于石油醚部位。 结果见表1。

表1 4 组对肺癌A549 细胞不同作用时间点IC50 值比较 μg／mL

2.3 石油醚部位的初步毒性考察 将30 只昆明小鼠随机分为6 组，每组5 只，分别标记为A、B、C、D、E、F 组，A 组为阴性对照组，每天灌胃蒸馏水；B、C、D、E、F 组分别以石油醚部位200、400、800、1 600、3 200 mg／kg 灌胃，每日1 次，连续给药7 d。给药结束后观察小鼠的状况与体质量变化并记录。

2.4 A549 肺癌移植瘤裸鼠模型建立及给药 收集状态良好处于对数生长期的肺癌A549 细胞，用胰蛋白酶消化后制成细胞母液，然后用PBS 稀释成浓度为1.5×107个／mL 单细胞悬液，立刻置于冰上，备用。 用酒精棉球擦拭注射部位，吸取0.2 mL 密度均匀的A549 单细胞悬液缓慢接种在每只裸鼠的右腋皮下，每只裸鼠接种3×106个细胞。 将35 只裸鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、低剂量组和高剂量组，每组7 只，接种第2 天开始给药。 阳性药组每只以0.2 mL 腹腔注射3 mg／kg 顺铂；空白组、模型组以蒸馏水灌胃；低剂量组、高剂量组分别以牛蒡根石油醚部位400、1 600 mg／kg 灌胃，每日1 次，连续给药15 d。

2.5 检测指标

2.5.1 记录鼠体质量和肿瘤体积 从给药当天算起，定期（隔天）称量裸鼠体质量并计算鼠体质量变化。 在所有裸鼠肿瘤长出后用游标卡尺测量肿瘤的长径（A）和短径（B），做好记录并计算瘤体积。

2.5.2 记录肿瘤质量和脏器指数 给药结束后，完整剥离腋窝皮下实体瘤，称取肿瘤质量，根据各组平均瘤质量（M）计算抑瘤率。 同时摘取脾脏、肝脏、肾脏和肺脏并称重，计算脏器指数。

3 实验结果

3.1 石油醚部位初步毒性考察 由表2 和表3 中结果可知：当给药量为1 600 mg／kg 时，小鼠出现干呕、挠鼻等反应，但很快恢复；当给药量增至3 200 mg／kg时，小鼠出现炸毛、双脚无力、流泪等不良反应，且恢复时间增至5 h，期间无小鼠死亡。石油醚部位各浓度组和蒸馏水组体质量均呈现逐渐增长趋势，其体质量变化与蒸馏水组比较无统计学意义（P＞0.05），说明石油醚部位对小鼠无明显毒性。 考虑到牛蒡根为药食同源性植物，为确保其药效，我们选择小鼠反应不太明显且很快恢复状态的剂量1 600 mg／kg作为后续实验的高浓度给药剂量，400 mg／kg 作为低浓度给药剂量。

表2 给药后小鼠一般状况比较

表3 不同给药剂量小鼠体质量变化比较（±s）g

表3 不同给药剂量小鼠体质量变化比较（±s）g

组别A 组B 组C 组D 组E 组F 组n555555给药剂量／（mg／kg）0 200 400 800 1 600 3 200初始体质量25.0±1.58 25.8±0.84 26.6±0.89 27.0±1.00 26.2±1.10 26.2±1.30 7 d 后体质量27.0±1.87 28.0±1.41 28.4±1.14 28.0±2.92 27.8±2.28 27.4±2.70体质量变化2.0±0.71 2.2±1.30 1.8±1.30 1.0±2.00 1.6±1.34 1.2±2.28

3.2 石油醚部位对移植瘤裸鼠体质量及脏器指数的影响 裸鼠在给药7 d 后均长出瘤体，实验期间移植瘤裸鼠未发现死亡。 由表4 可知：正常组、模型组、低剂量和高剂量组裸鼠体质量均出现不同程度的增长；与正常组和模型组比较，阳性药组裸鼠体质量变化和脾脏指数明显降低（P＜0.01），而其余实验组差异不明显（P 均＞0.05），这可能与阳性药对小鼠有较强毒副作用有关。

表4 各组裸鼠体质量变化及脾脏指数比较（±s）mg／g

表4 各组裸鼠体质量变化及脾脏指数比较（±s）mg／g

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.01。

组别正 常 组模 型 组低剂量组高剂量组阳性药组n77777体质量变化／g 1.29±1.89 2.14±1.07 1.86±0.69 1.57±0.98-2.43±1.131）2）脾脏指数4.29±1.20 4.92±1.13 4.33±1.12 4.04±0.74 2.84±0.311）2）肝脏指数43.89±7.35 43.58±3.20 44.52±4.38 40.45±4.49 45.20±3.96肾脏指数12.16±1.05 11.52±0.61 10.90±0.54 11.04±0.57 11.70±2.26肺脏指数6.64±0.36 6.67±0.47 6.52±0.99 6.35±0.43 6.05±0.84

3.3 石油醚部位对裸鼠移植瘤生长的影响 由表5 可知：模型组瘤体积生长迅速，在后面几天出现膨胀性增长；阳性药组、低剂量和高剂量组移植瘤体积增长速度与模型组比较明显减缓，其中阳性药组增长速度最慢，差异具有统计学意义（P＜0.01）。 由

表5 各组裸鼠瘤体积比较（±s）mm3

表5 各组裸鼠瘤体积比较（±s）mm3

注：与模型组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01。

组别模 型 组低剂量组高剂量组阳性药组n7777第7 天108.29±43.12 86.43±22.96 71.71±31.271）62.29±17.722）第9 天234.55±47.96 170.71±21.642）105.29±39.172）77.43±26.722）第11 天361.86±101.35 264.57±19.59 197.29±31.551）118.71±23.632）第13 天507.00±48.01 338.57±70.84 269.14±38.141）151.57±36.552）第15 天782.86±112.14 553.43±92.642）375.86±45.382）231.14±59.182）

图2 各组对移植瘤生长影响比较

表6 各组瘤重及抑瘤率比较（±s）

表6 各组瘤重及抑瘤率比较（±s）

组别模 型 组低剂量组高剂量组阳性药组n7777瘤重／g 1.42±0.31 1.10±0.13 0.74±1.20 0.42±0.19抑瘤率／%—22.65 48.03 70.43

4 讨 论

肿瘤的基本特征是细胞的无限增殖，而许多中药可通过抑制肿瘤细胞的增殖来发挥抗肿瘤作用［4］。肺癌是临床上常见的呼吸道恶性肿瘤，其发病率随着现代环境和生活方式的变化而增加，是肿瘤相关死亡的主要原因，其五年生存率低至18%［5-6］。 MTT法是分析细胞活性和检验细胞增殖的常用方法［7-8］。目前已有牛蒡根提取物对人白血病、肾癌、乳腺癌、胃癌细胞及小鼠肝癌、S180 腹水瘤细胞的体外增殖抑制作用研究，但未见其对人结肠癌、肺癌细胞的体外增殖抑制作用以及牛蒡根成分活性研究。 同时，牛蒡根归肺、胃经，因此，挑选肺癌A549 细胞进行体外活性筛选，以期得到抗肿瘤活性部位。 MTT体外结果显示：石油醚部位对肺癌A549 细胞的增殖有较明显的抑制作用，而乙酸乙酯和多糖部位则无明显影响，说明牛蒡根抗肿瘤的活性部位可能是其石油醚部位。 体内A549 肺癌小鼠移植瘤结果显示：石油醚给药组裸鼠体质量及各脏器指数无显著变化，但能明显抑制瘤体体积的增长和瘤体质量，且其抑制作用随着浓度的增大而增强，而顺铂组裸鼠体质量和脾脏指数则出现明显下降。 这说明石油醚部位能抑制A549 移植瘤的生长，具有浓度依赖性，且毒副作用较小。

石油醚部位主要含挥发油等挥发性成分及一些小分子成分［9］。 研究发现中药挥发油能显著地抑制肺癌、结肠癌、肝癌及胃癌细胞的增殖生长［10］，由此可见，牛蒡根发挥抗肿瘤作用可能与其所含的挥发油成分有关。