菊芋叶片提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果及盆栽验证试验

李屹　韩睿　王丽慧　等

摘要：采用生长速率法，对菊芋叶片5种溶剂提取物进行辣椒疫霉菌抑菌效果试验，结果表明，不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，石油醚和乙酸乙酯为溶剂的菊芋叶片提取物12.5 mg/mL对辣椒疫霉菌的抑菌率最高，达到100.00%；在各溶剂提取物不同浓度梯度情况下，乙酸乙酯提取物的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率已达到100.00%，浓度降到2.5 mg/mL时，抑菌率为（27.91±2.076）%，显著高于同浓度其他溶剂的提取物。对菊芋叶片乙酸乙酯提取物50倍液进行防治辣椒疫病的盆栽试验，结果表明，其对辣椒疫病的防治效果达到10000%，优于化学药剂25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液的防治效果。

关键词：菊芋；提取物；辣椒；疫霉菌；抑菌效果；石油醚；乙酸乙酯

中图分类号： S482.2+92文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0139-02

收稿日期：2014-04-02

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-25-G-49）。

作者简介：李屹（1973—），女，河南巩义人，研究员，主要从事蔬菜病虫害防治。Tel：（0971）5311167；E-mail：ly525414@sina.com。辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）侵染引起的一种毁灭性真菌性病害，于1918年在美国首次被发现，迄今已在世界各地的辣椒种植区普遍发生[1]。在20世纪50年代，我国最早在江苏发现辣椒疫病，目前该病已危及我国的青海、新疆、上海、北京、陕西、贵州、四川等许多地区[2-8]，并呈逐年加重趋势，给辣椒生产造成严重损失，是辣椒的主要病害之一。辣椒疫病是一种土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，发病时可造成茎秆坏死、叶片枯萎、果实腐烂，甚至整株萎蔫死亡，从而导致田间大面积出现死秧[9]。利用化学药剂防治辣椒疫病效果甚微，且容易造成环境污染，开发无害、高效的新型生物农药是当前病害防治的发展方向。本试验采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇共5种溶剂，对菊芋叶片的有效成分进行提取，对提取物进行辣椒疫霉菌抑菌效果试验，确定最佳溶剂，并开展辣椒盆栽验证试验，为利用菊芋开发高效、安全的新型无公害植物源农药奠定基础。

1材料与方法

1.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的室内抑菌效果

1.1.1供试样品供试植物为菊芋，种植于青海大学农林科学院，鲜叶于秋季霜前采集，室内自然阴干，用粉碎机粉碎制成植物干粉，密封于塑料袋中备用。

1.1.2培养基与试剂真菌培养基为 PDA 培养基；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮及乙醇等生化试剂均为分析纯，市购。

1.1.3供试菌种辣椒疫霉菌菌种由青海省蔬菜遗传与生理重点实验室提供，将菌株接种于PDA液体培养基中进行活化，25 ℃培养2～3 d；活化菌株转接到PDA固体平板上，25 ℃ 培养2～5 d，至菌丝覆盖整个平板。

1.1.4菊芋叶片不同提取物的制备5种溶剂提取物提取方法分别为：分别称取菊芋叶片干粉材料2、1.2、2.4、2、3 kg，分别加入乙醇10 L、氯仿6 L、乙酸乙酯12 L、丙酮10 L、石油醚15 L，浸提2次，浸提2 d；合并2次浸提液，减压浓缩，分别得到菊芋叶片乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和石油醚粗提物。

1.1.5菊芋叶片提取物的抑菌活性测定将各粗提物配制成一定浓度；一方面分别取一定量各溶剂提取物加入到温度40 ℃左右、已熔化的PDA固体培养基中，摇匀，倒入灭菌培养皿中，使菊芋叶片提取物在PDA培养基中终浓度为 12.5 mg/mL，以添加相对应的有机溶剂为对照，另一方面使各菊芋叶片提取物在PDA培养基中的终浓度分别为25、20、15、12.5、10、7.5、5、2.5 mg/mL；待培养基凝固，于中央接入直径为9 mm 的辣椒疫霉菌菌块，于25 ℃培养72 h，“十”字交叉法测量菌落直径，计算菌落纯生长量和抑菌率：纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径；抑菌率=（对照纯生长量-处理纯生长量）/对照纯生长量×100%。

1.1.6数据分析数据用Excel和DPS软件进行分析处理。

1.2盆栽验证试验

1.2.1供试材料供试辣椒品种为乐都长辣椒；供试试剂为菊芋叶片乙酸乙酯粗提物和25%甲霜灵可湿性粉剂。

1.2.2试验方法辣椒采用盆栽，每盆栽种辣椒3株，在辣椒8～10叶期处理；试验设菊芋叶片粗提物50倍液、25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液、清水处理为空白对照共3个处理，采用灌根方式，沿每株辣椒根部灌入10 mL试剂或清水；24 h后使用注射器吸取游动疫霉菌孢子浓度为1×104个/mL 的悬浮液5 mL，注入离辣椒幼苗根茎约2 cm处，保持土壤湿度饱和、温度为25 ℃左右。每个处理重复3次，每次重复用辣椒5盆。孢子悬浮液制备方法为：将在CN培养基上培养的疫霉菌单孢纯化菌株，于28 ℃条件下连续光照培养5～7 d以形成大量孢子囊；挑取产生孢子囊的菌丝块放入试管中，加入无菌水20 mL，放入4 ℃冰箱中预冷1 h，移至室温20 min，振荡即得游动孢子悬浮液，用无菌水进行稀释调节。

1.2.3调查内容及统计方法分别于施药后7、14、21 d调查发病情况，统计发病率、病情指数及防治效果，计算公式：发病率=发病株数/调查总株数×100%。病情指数DI：DI=∑（s×n）/（N×5）×100%，式中，s为各病情级别的代表数值；n为各病情级别的植株数；N为调查总植株数。防治效果=（对照区病情指数-防治区病情指数）/防治区病情指数×100%。病害分级标准为：0级：无病；1级：幼苗根茎部轻微变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2级：幼苗根茎部变黑1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3级：幼苗根茎部变黑超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4级：幼苗根部变黑缢缩，除生长点外全部落叶或整株萎蔫；5级：植株枯死。

2结果与分析

2.1菊芋叶片不同溶剂提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果

由表1可知，菊芋叶片各溶剂提取物12.5 mg/mL处理，辣椒疫霉菌的菌丝纯生长量与对照处理相比，均存在显著差异，各溶剂提取物对真菌生长均起到一定的抑制作用；石油醚、乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑制效果最好，抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物处理；丙酮提取物次之，抑菌率为（27.51%±2.823）%；乙醇提取物对疫霉菌抑菌效果相对最差，抑菌率仅为（3.99±1.009）%。

表1菊芋叶片不同溶剂提取物12.5 mg/mL对辣椒疫霉菌的抑菌效果

溶剂纯生长量（cm）菊芋叶片提取物仅溶剂（对照）抑菌率

（%）石油醚0±0e1.35±0.089100.00±0a乙酸乙酯0±0e5.20±0.347100.00±0a氯仿13.92±0.454c17.20±0.32719.10±1.282c丙酮5.25±0.278d7.24±0.10627.51±2.823b乙醇32.22±0.202b33.56±0.5443.99±1.009d空白对照45.20±0.700a注：同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

由表2可知，乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达100.00%，当浓度降到2.5 mg/mL时，抑菌率为（27.91±2.076）%；石油醚提取物的抑菌效果次之，浓度为7.5 mg/mL时，抑菌率达10000%，当浓度逐渐降低时，抑菌率也显著降低；氯仿提取物和丙酮提取物在2.5～10 mg/mL时的抑菌效果相差不大，浓度大于10 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌效果增加程度明显大于氯仿，在20 mg/mL时，丙酮提取物的抑菌率达10000%，氯仿提取物在25 mg/mL时抑菌率才达到100.00%；乙醇提取物的抑菌效果最差，浓度小于10 mg/mL几乎没有抑菌效果，当浓度大于12.5 mg/mL时，抑菌率随浓度的增加而增大，当浓度为 25 mg/mL 时，抑菌率为（72.43±0.472）%。表2不同溶剂

2.2菊芋叶片提取物防治辣椒疫病盆栽验证试验

由表3可知，施药后7 d，菊芋叶片粗提物50倍液及25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液2个处理均未发病，清水对照发病率达17.78%、病情指数达4.00%；施药后14 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为8.89%、病情指数为178%，清水对照发病率达37.78%、病情指数达14.67%；施药后 21 d，菊芋叶片粗提物50倍液处理的辣椒仍未发病，25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液处理的辣椒发病率为13.33%、病情指数为4.89%，病情发展较为缓慢，清水对照发病率达到57.78%、病情指数达到35.11%。菊芋叶片提取物50倍液处理的辣椒全程无疫病发生，对辣椒疫病有较好的防治效果。表3菊芋叶片提取物对辣椒疫病的防治效果

3结论与讨论

试验结果表明，菊芋叶片不同提取物对辣椒疫霉菌均具有抑菌效果，溶剂提取物浓度为12.5 mg/mL时，石油醚和乙酸乙酯提取物对辣椒疫霉菌的抑菌率达到100.00%，显著高于其他提取物；乙酸乙酯提取物的抑菌效果最为显著，当浓度为5 mg/mL时，抑菌率达到100.00%， 浓度降到2.5 mg/mL时， 抑菌率尚有（27.91±2.076）%，显著高于同浓度其他溶剂提取物；菊芋叶片乙酸乙酯提取物50倍液对辣椒疫病具有良好的防治效果，药后21 d防效仍达到100.00%，优于化学药剂25%甲霜灵可湿性粉剂 400倍液的防治效果。

我国是农业大国，农药在农业生产中发挥着十分重要的作用。随着人们健康意识的提高，农药残留超标已成为严重影响农产品市场竞争力的重要问题，开发新型农药已成当务之急[10]。植物源农药来源于自然，具有环保、长效、易光解、无残留等特点，能保持农产品的高品质， 是发展有机农业、促进农业可持续发展的理想农药。菊科植物是最重要的植物源农药来源，在有杀虫活性的1600种植物中，有1/10是菊科

植物[11]。研究表明，菊芋能抵御多种植物疾病，极少虫害，含有抗虫抑菌活性物质，具有耐旱、耐寒、耐盐及抗病虫害等特点[12]。目前，国内外对菊芋用于治理沙漠和深加工方面的研究较多，有关菊芋叶片生物活性物质及其抑菌活性的研究较少。韩睿等已经开展菊芋叶片有效成分提取分离技术研究[13]。通过本试验，证明了菊芋提取液对辣椒疫霉菌具有很好的抑制作用，这对于充分利用菊芋资源、开发研制新型植物源杀菌剂、拓展菊芋的应用领域提供了一定的依据。在盆栽验证试验中，只设定了1个提取液浓度，不能更为客观地分析其防治效果，有必要在后续试验中设计更多的浓度梯度，进一步确定菊芋提取液对辣椒疫病的防治效果及最佳防治浓度。

参考文献：

[1]朱宗源，陆金萍，周新根，等. 上海郊区青椒疫病病原菌鉴定及其生物学特性[J]. 上海农业学报，1992，8（3）：36-41.

[2]陈坚忠. 青海高海拔地区辣椒疫病的发生及防治措施[J]. 作物杂志，2008（4）：83-84.

[3]程沄，沈崇尧，段道怀. 青椒疫菌为北京地区青椒死秧的主要原因[J]. 植物病理学报，1988，18（1）：9-14.

[4]王志田，史载诚，赵林忠，等. 哈密地区辣椒疫霉菌的鉴定及部分生物学测定[J]. 新疆农业科学，1990（2）：69-71.

[5]王燕华，杨顺宝. 上海地区甜椒疫病菌的鉴定[J]. 上海农业科技，1982（1）：20-21.

[6]常彩涛，巩振辉，王鸣. 陕西辣椒疫病菌种的鉴定[J]. 西北农业学报，1993，2（1）：87-90.

[7]杨学辉，袁洁，谢海呈. 贵州省辣椒主栽品种抗疫病性鉴定[J]. 西南农业学报，2005，18（6）：791-793.

[8]彭化贤，刘波微，李薇. 四川辣椒疫霉菌生物学特性和辣椒抗霉疫病性鉴定方法初探[J]. 云南农业大学学报，2005，20（1）：140-144.

[9]易图永，谢丙炎，张宝玺，等. 辣椒疫病防治研究进展[J]. 中国蔬菜，2002（5）：52-55.

[10]吴光旭，何庭玉，刘爱媛，等. 植物中抗病原真菌的活性物质[J]. 植物学通报，2004，21（3）：367-375.

[11]李云寿，邹华英，唐绍宗，等. 14种菊科植物提取物对菜青虫的杀虫活性[J]. 华东昆虫学报，2000，9（2）：99-101.

[12]Stanley J K，Nottingham S F. Biology and chemistry of Jerusalem artichoke[M]. New York：CRC Press，2008.

[13]韩睿，王丽慧，钟启文，等. 菊芋叶片提取物抑菌活性研究[J]. 现代农业科技，2010（5）：120-123.高宇，王志英，赵红盈，等. 白蜡吉丁啮小蜂雌蜂对寄主挥发物的触角电位和行为反应[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：141-143.