益景汤对早期糖尿病大鼠脑微血管病变的影响及作用机制

王 丽，刘光辉，林 韵，张洪生，高爱明，孟 春，赵 利，周子鑫

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成为危害人类健康最大的疾病之一，中国是目前全球糖尿病患者人数最多的国家，2017 年流行病学调查显示中国糖尿病总患病率高达11.2%［1］。 DM 并发症众多，长期高血糖会导致患者出现不同程度的学习和记忆能力下降，严重者会出现认知功能障碍甚至痴呆，临床称此为糖尿病脑病（diabeticencephalopathy，DE），发病原因可能与长期高血糖导致脑微血管病变有关［2］，具体机制尚不十分明确。

有研究表明：DM 代谢产物——晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products，AGEs）能够激活TGF-β1／Smads 信号通路，诱导脑微血管相关结构蛋白表达异常，损伤血脑屏障，引起脑微血管病变［3］。 益景汤是福建中医药大学附属人民医院治疗DM 微血管病变的有效经验方， 临床应用多年。本团队临床研究表明益景汤能够改善DM 患者眼部微血管循环［4-6］，降低糖尿病心肌病的血清学指标，对糖尿病心肌病有较好疗效［7］，可有效改善早期DM 肾病患者症状［8］。 动物实验表明益景汤能够改善DM 大 鼠 眼 部［9-11］、心 脏［12］、肾 脏［13］的 血 流 动 力学，保护相应的器官功能，但在治疗脑微血管病变方面尚无相应研究。 本研究拟在前期研究基础上，采用DM 大鼠模型，基于TGF-β1／Smads 信号通路，研究益景汤对早期DM 脑微血管病变的影响。

1 材 料

1.1 实验动物 雄性健康清洁级SD 大鼠，鼠龄5～6 周，体质量（200±20）g，购买自福州诺顿斯生物科技有限公司，合格证号：20170012009954，饲养于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（闽）2020-0002，饲养环境温度21～25 ℃，相对湿度为50%～55%。 普通颗粒饲料喂养，自由饮水，12 h／12 h 明暗交替光照。 实验动物的处理按国家科学技术委员会1988 年颁布的《实验动物管理条例》执行。

1.2 实验试剂 链脲佐菌素（美国Sigma-Aldrich 公司）；一抗（英国Abcam 公司），包括：晚期糖基化终产物特异性受体（RAGE）、转化生长因子β1（TGFβ1）、同源物4 重组蛋白（Smad4）、纤维连接蛋白（fibronectin）、紧密连接蛋白5（claudin-5）、Ⅳ型胶原蛋白（collagenⅣ）；二抗（福州迈新生物技术开发有限公司）；WB 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；柠檬酸盐（北京中杉金桥生物技术有限公司）；10%中性福尔马林固定液（北京百奥莱博科技有限公司）；血糖试纸（拜耳医药保健有限公司）。

1.3 实验药物 益景汤（福建省名老中医金威尔有效经验方），组成：生黄芪15 g，山药15 g，苍术9 g，桃仁5 g，红花5 g，当归9 g，川芎6 g，赤芍10 g，茯苓15 g，生地黄15 g，玄参15 g。 每剂水煎至50 mL（药物浓度约2.38 g／mL），灭菌玻璃瓶灌装，密封避光备用。

2 方 法

2.1 造模及分组 将健康雄性清洁级SD 大鼠30 只随机分为正常组、模型组、益景汤组，每组10 只。 正常组常规喂养，其余2 组进行DM 模型制备［11］。适应性喂养7 d，禁食12 h 后，将链脲佐菌素用0.1 mmol／L、pH 值4.5 的无菌柠檬酸缓冲液溶解，配置成1%溶液后，按70 mg／kg 剂量进行一次性腹腔注射。 72 h 后取大鼠尾血检测血糖，血糖浓度≥16.7 mol／L 即视为DM 模型制备成功。

2.2 给药 正常组常规喂养；益景汤组予益景汤水煎液灌胃，按10.71 g／（kg·d）计算，取药1.35 mL，加蒸馏水稀释至3 mL，一次性灌胃，每日1 次；模型组给予生理盐水3 mL／d 一次性灌胃，每日1 次。 2 组分别干预16 周。

2.3 取材及制片 各组大鼠干预16 周后，采用一氧化二氮吸入麻醉后，记录体质量；脱椎处死3 组大鼠，剪开颅骨，剥离出完整脑组织，记录脑实质重量，并测量体积。 沿矢状面对剖，取一半放入液氮保存，另一半沿矢状面2 mm 厚度切片，放入包埋盒，投入10%中性福尔马林固定24 h 后行病理切片制备。

2.4 Western blot 检测 取出3 组液氮保存的脑组织，匀浆、裂解后置入离心管中，4 ℃条件下离心5 min，取上清液进行蛋白含量测定；SDS-PAGE 凝胶电泳；将3 组蛋白转移至硝酸纤维素薄膜，5%牛奶37 ℃封闭1 h 后，加入RAGE、TGF-β1、Smad4、fibronectin、claudin-5、collagen Ⅳ和GAPDH 一 抗，4℃孵 育 过夜；TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗37 ℃孵育2 h；TBST 洗膜3 次，ECL 发光、显影、定影后室温下晾干、扫描，以GAPDH 作为内参，凝胶图像处理系统分析各目标带的分子量和净光密度值，获取目的蛋白的相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 23.0 进行统计学分析。 计量资料属正态分布的以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著性差异法（LSD 法）。

3 结 果

3.1 3 组大鼠一般情况比较 见表1。

表1 各组大鼠一般情况比较（±s）

表1 各组大鼠一般情况比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

脑实质重量／g 1.91±0.15 1.59±0.031）1.73±0.061）组别正 常 组模 型 组益景汤组n 10 10 10体质量／g 519.02±21.39 196.28±22.491）211.30±27.301）脑体积／cm3 3.81±0.66 2.09±0.291）3.49±0.592）

3.2 3 组大鼠脑微血管的光镜观察 重点观察3 组大鼠脑组织海马区域。 正常组脑组织见少量毛细血管增生，管壁薄，无充血、出血；益景汤组与正常组比较，毛细血管略增生，管壁稍增厚，管腔稍充血；与模型组比较，毛细血管增生缓解，血管壁相对较薄，未见明显充血及出血区域。 见图1。

图1 光镜下3 组大鼠脑微血管形态观察（×400）

3.3 3 组大鼠脑神经细胞的光镜观察 重点观察3 组大鼠脑组织海马区域。 正常组脑组织海马结构清晰，神经元、胶质细胞数量及形态正常；益景汤组与正常组比较，胶质细胞数量明显增加；与模型组比较，缺血神经元明显减少，未见神经纤维缠结，胶质细胞数量增多、体积增大。 见图2。

图2 光镜下3 组大鼠脑神经细胞形态观察（×400）

3.4 3 组对大鼠TGF-β1／Smads 信号通路相对蛋白表达量比较 见图3。

图3 3 组TGF-β1／Smads 信号通路相对蛋白表达量比较

4讨 论

DE 是DM 微血管并发症之一， 其发病原因可能与脑微血管病变导致脑部缺血有关［14-15］。 与机体其他血管系统比较，脑微血管分布错综复杂，机体为了保障脑内微环境的稳定，形成了一个特殊的微血管结构——血脑屏障（BBB），主要由血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成［16-17］。 血管内皮细胞通过紧密连接蛋白彼此紧密连接，奠定了BBB最基本的结构基础，血管基底膜进一步维持其结构的稳定性。claudin-5 是构成细胞间紧密连接的主要组分，在内皮细胞上高表达，有研究表明claudin-5 缺失会导致BBB 发生选择性渗漏［18］。 BBB 的基底膜主要由细胞外基质组成， 包括fibronectin、collagenⅣ等［19］。

有研究表明：机体在长期高血糖状态下，AGEs 过度积累，与脑血管内皮细胞与周细胞表面的RAGE结合，激活下游信号通路，导致脑微血管病变［20］。TGF-β1／Smads 信 号 通 路 是 其 中 的 重 要 通 路［21］，AGEs 与RAGE 结合后，诱导脑血管内皮细胞、周细胞表达TGF-β1，激活Smads 信号通路，Smad2／3 磷酸化后与关键亚基Smad4 形成异聚复合体，将信号从胞浆转移到胞核中。 一方面诱导脑血管内皮细胞、周细胞分泌fibronectin、collagenⅣ，导致血管基底膜增厚，管腔变窄，加上糖尿病患者脂质代谢紊乱，血液黏稠度升高，血流缓慢，导致微血栓形成或微血管闭塞，使脑血流灌注明显减少；另一方面抑制内皮细胞分泌claudin-5，破坏细胞间的紧密连接，破坏BBB 的完整性，使BBB 通透性升高，破坏大脑微环境的稳态，引起神经元的损害和凋亡，最终导致DE 的发生［22］。

中医学认为DE 属于“健忘”“呆症”范畴，基本病机以气阴两虚为本，以血瘀为标。 长期糖尿病导致气虚血行无力，瘀血内停，阻滞脑络，蒙蔽脑窍。因此DE 的中医治疗应以“益气养阴、活血通络”为原则。

益景汤是我院用于防治早期DM 微血管病变的有效经验方，临床应用20 余年，是福建省名老中医金威尔在益气活血名方——补阳还五汤的基础上，去地龙，加山药、苍术、茯苓、玄参、生地黄而成。方中生黄芪益气，生地黄、玄参养阴生津，山药、苍术、茯苓健脾，桃仁、红花、当归、川芎、赤芍活血化瘀。 全方共奏益气养阴、活血通络之功效，组方符合中医防治DE 的基本原则， 具有中医 “治本” 的优势。 团队前期临床研究表明：益景汤对于改善DM患者眼部、心肌、肾脏微血管循环，保护相应脏器功能均有一定的疗效［4-13］。

本研究结果显示：①高血糖导致大鼠体质量明显减轻，脑实质萎缩，大脑体积下降，益景汤可以改善这些症状，对大脑正常体积的维持作用尤为明显；②高血糖导致大鼠脑组织缺血神经元明显增多，甚至出现神经纤维缠结（神经元的一种病理变化，与老年性痴呆相关），益景汤可以缓解高血糖导致的脑部缺血性变化，缓解脑萎缩，改善脑部血流灌注；③高血糖导致大鼠脑组织TGF－β1／Smads 信号通路的关键蛋白TGF－β1 和Smad4 表达升高，下游血管相关结构蛋白fibronectin 和collagenⅣ表达升高，claudin-5 表达降低，提示该通路是DM 脑微血管病变的发病机制之一。益景汤可以通过调节TGFβ1／Smads 信号通路相关蛋白的表达异常，保护细胞间的紧密连接，保护血管基底膜，对于维持脑微血管正常结构及功能有一定的效果。

综上，益景汤能一定程度的改善早期DM 大鼠的消瘦和脑组织萎缩，并通过调节TGF-β1／Smads信号通路相关蛋白的表达，改善DM 大鼠早期脑微血管损害，改善脑部血流灌注。 对TGF-β1／Smads信号通路的调控可能是益景汤干预早期DM 脑微血管病变的作用机制之一。