补肾法对围绝经期综合征大鼠性激素及卵巢雌激素受体的影响

谢冰颖，黄景文，陈赛楠，谢丽华，李生强

（福建省中医药科学院基础研究所，福建 福州 350003）

很多女性约从45 岁起，卵巢机能衰退老化，体内雌激素水平的降低破坏了神经-内分泌系统的平衡，继而引起了围绝经期妇女出现心烦、易醒、情绪易躁动等临床症状，称为围绝经期综合征（perimenopausal syndrome，PPS）［1］。 PPS 在围绝经期妇女中发病率较高，对妇女身体、精神等方面都造成影响，损害了围绝经期妇女的身体、心理健康。 PPS 证候特征与“经断前后诸证”“年老经断复来”等症状相似［2］。 中医学认为PPS 是肾气逐渐衰弱，女性天癸即将竭尽，人体阴阳失衡所致，故常治以补肾法，效果显著［3-5］，但补肾法治疗PPS 机制不明确。 本研究观察左归丸、右归丸对PPS 大鼠性激素水平、卵巢雌激素受体alpha（ERα）及雌激素受体beta（ERβ）mRNA 相对表达量影响，探讨补肾法治疗PPS 的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 24 只9 月龄SPF 级雌性SD 大鼠购自北京维通利华公司［许可证号SCXK（京）2014-0001］，在福建省中医药科学院比较医学实验中心饲养3 个月，达12 月龄，体质量达370～420 g；另从该公司购买8 只11 周龄SD 大鼠，体质量250～280 g，适应饲养1 周后即12 周作为育龄期的对照组大鼠。

1.2 试剂和仪器 总RNA 抽提Trizol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号：68304）；逆转录试剂盒（批号：AK3302）、定量PCR 检测试剂盒（批号：AK7602）均购自宝生物工程（大连）有限公司；ND2000 微量核酸测定仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；7500 fast 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）。

1.3 药物制备 按照张介宾《景岳全书》组方，左归丸处方：熟地黄24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，菟丝子12 g，鹿角胶6 g，龟甲12 g，川牛膝9 g。右归丸处方：熟地黄24 g，山药12 g，枸杞子9 g，山茱萸9 g，菟丝子12 g，杜仲12 g，鹿角胶12 g，当归9 g，肉桂6 g，制附子6 g。 中药药材均购自福建省鹭燕医药有限公司，方药剂量均按临床成人剂量的6.3 倍计算。 煎煮方法参见文献［6］，首煎加冷水没过中药，浸泡30 min，武火煮沸后文火继续煮20 min；次煎再加冷水没过中药，武火煮沸后再文火煮20 min；分别将两次药液过滤、合并。 左归丸组分中的鹿角胶、龟甲分别另外加热溶解，加入滤液中。 采用旋转蒸发仪浓缩成生药浓度为1.39 g／mL左归丸水煎剂、1.24 g／mL 右归丸水煎剂。 密封，置于4 ℃冰箱保存备用。

2 实验方法

2.1 模型建立及评价 以阴道脱落细胞形态及数量变化判断大鼠动情周期。 收集24 只9 月龄SPF级SD 大鼠阴道脱落细胞，在载玻片上作细胞涂片，酒精固定1 min，碱性美蓝染色，镜下观察脱落细胞形态变化；连续观察10 d（2 个动情周期），以动情周期紊乱、不明显判定为PPS 模型［7］。

2.2 动物分组及干预 将24 只PPS 模型大鼠根据随机数字表法分为模型组、左归丸组、右归丸组，每组8 只；12 周龄、体质量250～280 g 的SD 大鼠作为对照组［7］。 左归丸组、右归丸组分别采用左归丸水煎剂、右归丸水煎剂1 mL／100 g 灌胃；对照组、模型组灌胃等体积生理盐水。 每日上午灌胃1 次，连续给药21 d。

2.3 组织标本的采集 干预结束后第2 天上午9：00-10：00 采用戊巴比妥（1 mL／100 g）麻醉大鼠，腹主动脉采血；后打开腹腔，剥离卵巢，剔除卵巢旁脂肪，置冻存管并立即投入液氮中速冷，后存于-80 ℃超低温冰箱备用。 获取的新鲜血液于4 ℃冰箱静置2 h 后，在4 ℃条件下，以3 000 r／min 离心机离心20 min，取血清，置-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

2.4 血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）检测 委托北京301 医院采用放射性免疫技术进行检测。 将标准品和受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定温度下反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡；采用第二抗体法进行沉淀，离心分离，然后进行放射性强度的测定。

2.5 卵巢总RNA 提取 将剪碎的卵巢组织以Trizol裂解法沉淀，溶解在一定量水即得到大鼠卵巢总RNA。 总RNA 的浓度测定采用微量核酸测定仪检测OD260、OD280，根据公式计算总RNA 浓度，通过OD260／OD280比值分析总RNA 纯度。

2.6 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测卵巢ERα mRNA 及ERβ mRNA 相对表达量 逆转录mRNA获得cDNA 后，按照定量PCR 试剂盒说明操作。 采用不同管同时扩增管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，每个基因同时扩增3 个重复管，进行RT-PCR 检测。 大鼠ERα、ERβ 基因引物上下游碱基序列及扩增产物大小见表1。

表1 定量PCR 引物序列

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据统计分析。 计量资料符合正态分布的以（±s）表示，采用单因素方差分析；不符合正态分布的采用秩和检验。

3 结 果

3.1 各组大鼠给药前后体质量变化比较 给药后各组大鼠体质量较同组给药前有增加趋势，但无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠给药前后体质量变化比较（±s）g

表2 各组大鼠给药前后体质量变化比较（±s）g

组别对 照 组模 型 组左归丸组右归丸组n8888给药前277.5±11.4 379.3±17.0 384.5±16.0 383.1±15.3给药后286.9±18.5 386.5±19.1 390.1±17.3 389.8±13.1

3.2 各组大鼠血清激素水平比较 见表3。

表3 各组大鼠血清激素水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清激素水平比较（±s）

注：与对照组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与模型组比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

组别对 照 组模 型 组左归丸组右归丸组LH／（mIU／mL）6.42±0.63 8.52±0.682）7.11±0.433）6.89±0.523）n8888 E2／（pg／mL）84.68±8.92 54.45±5.202）68.72±4.873）72.37±5.484）FSH／（mIU／mL）4.54±0.56 5.66±0.571）4.37±0.424）4.42±0.344）

3.3 各组大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA 相对表达量比较 见表4。

表4 各组大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.01。

ERβ mRNA 0.95±0.27 1.78±0.481）2.30±0.68 2.37±0.78组别对 照 组模 型 组左归丸组右归丸组n8888 ERα mRNA 0.91±0.30 2.08±0.521）4.04±1.002）2.92±0.85

4 讨 论

围绝经期综合征确切的发病机制还有待进一步研究，多数认为与卵巢功能减退，雌激素合成下降密切相关［8］。 近年的研究也发现：无论是PPS 患者还是PPS 动物模型，都有低雌激素水平及高FSH和高LH 的现象［3，9］。 此前，西方医学采取激素替代疗法（HRT）来治疗围绝经期综合征，疗效显著，但由于HRT 存在致癌的风险，因此临床治疗受到很大限制［9］，而中医药辨证施治因毒副作用小逐渐被临床所重视。

本研究中各组大鼠体质量在治疗后有一定增加，与治疗前比较，均未达到统计学意义，这可能与给药时间较短有关。 经左归丸、右归丸水煎剂分别灌胃21 d 之后，本研究发现大鼠外周血的雌激素水平显著提升。 究其原因，一方面，与补肾中药改善卵巢功能有关，比如增加卵巢颗粒细胞及黄体的雌激素合成能力［10-11］；另一方面，也与补肾中药提高卵巢外其他组织芳香转化相关，即提高肾上腺皮质、肝、皮下脂肪等组织的芳香转化能力，从而提高雌激素水平。

雌激素需要与其受体相结合起作用，并以此激活下游激素受体，从而传递给下丘脑-垂体-卵巢轴。机体内的雌激素受体水平在整个生命过程中是变化的。ERα、ERβ 是雌激素结合的两个靶点，分别由不同的基因编码组成，在体内的生物学特性上存在许多的差异，在调节下丘脑-垂体-卵巢轴中占据重要地位［12］。 本研究发现模型组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA 相对表达量均比对照组大鼠高，分析其原因，可能是雌性大鼠在围绝经期时，雌激素水平较低，而较高的ERα mRNA、ERβ mRNA 表达水平保证雌激素受体蛋白的水平，从而在一定程度上维持雌激素效应［13-14］。

左归丸、右归丸治疗PPS 对大鼠卵巢雌激素受体的影响尚未见报道，但对于阿尔茨海默病（AD）细胞模型，左归丸含药血清可以提高雌激素受体表达［15］。 本实验中左归丸组大鼠卵巢ERα mRNA 相对表达量显著增高，与益肾更宁合剂［16］、补肾壮骨颗粒［17］报道的作用基本一致。 左归丸、右归丸组大鼠卵巢ERβ mRNA 相对表达量虽然有所提高，但无统计学意义。 因细胞、组织类型的不同，ERα mRNA和ERβ mRNA 表达水平存在一定差异。 本研究中，围绝经期大鼠经左归丸、右归丸灌胃后，随着血液雌激素水平的提高以及卵巢ERα mRNA 表达的增强，雌激素的生物效应也得以维持。

本研究也发现：与右归丸组比较，左归丸组ERα mRNA 相对表达量更高，但并没有达到显著性差异。本研究建立的PPS 大鼠模型并没有涉及中医证型，对于左归丸和右归丸药效的发挥可能有影响。 今后如果能建立肾阴虚或肾阳虚PPS 大鼠模型，对于探讨左归丸或右归丸的作用机制将更有意义。

本研究以补肾法治疗围绝经期模型大鼠，结果证实了补肾法对调节围绝经期综合征大鼠的外周血雌激素及卵巢ERα mRNA 表达具有重要影响。通过提高血液雌激素及卵巢ERα mRNA 水平进而提高雌激素效应可能是补肾法治疗PPS 的内在机制。