原发性胆汁性胆管炎患者血浆细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4基因多态性分析

李衍强，石 慧，王文珊，林学贤，王英运

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)属于自身免疫性肝病，是免疫功能紊乱介导的进行性非化脓性胆管炎，可导致肝内中小胆管损伤和肝内胆汁淤积，最终可从肝纤维化发展为肝硬化[1，2]。有研究表明[3]，PBC 的发生具有一定的家族倾向性，患者直系亲属患PBC的风险是一般人群的50～100倍，且同卵双胞胎共同患病概率高达63%左右。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4( cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4) 属于免疫球蛋白超家族基因成员，与CD28有70%的同源性，主要以二聚体的形式表达于T细胞表面，在CD4+T细胞激活过程中具有关键性作用，能触发机体整个T细胞群增殖和相关的细胞因子合成下调，抑制免疫应答反应[4，5]。CTLA-4基因具多个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点。SNP的存在从不同方面影响着CTLA-4基因的表达。既往对于CTLA-4基因多态性的研究多集中在胃癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等人类肿瘤和类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等疾病[6-8]。本研究检测了PBC患者外周血CTLA-4基因多态性，旨在为该病的发病机制研究提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年9月～2020年12月我院收治的PBC患者30例，男性2例，女性28例；年龄为43～65岁，平均年龄为(59.4±5.5)岁。符合2015年发布的胆汁淤积性肝病诊断和治疗共识中有关PBC的诊断标准[9]。排除标准：合并恶性肿瘤、精神异常或其他认知功能障碍、合并心、肺、肾、肠胃等其他重要脏器严重疾病、病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝炎、合并高血压、糖尿病、存在感染、外伤等应激状态。另选择同期在我院体检、无肝肾功能异常、糖尿病、高血压病的健康人35例作为对照组，男性3例，女性32例；年龄为42～66岁，平均年龄为(58.6±5.1)岁。入组人员签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 血浆CTLA-4基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测血浆CTLA-4基因rs231775、 rs4675369和rs7599230位点多态性。抽取静脉血6 mL，其中4 mL与乙二胺四乙酸混合后，保存于-80 ℃冰箱中备检，用于DNA提取。使用贝克曼AMPurea XPDNA血液基因组提取试剂盒提取样本基因组，双蒸水溶解，样本经检测纯度合格后，-80℃条件下保存。针对CTLA-4基因rs231775、 rs4675369和rs7599230位点，参照美国Sequenom公司提供的序列设计引物，由苏州泓迅生物科技有限公司负责合成。通过Sequenom MassAR-RAY 技术对位点进行分型。(1)目的基因扩增：取适量基因组DNA，加入96孔板，取DNA 5 ng，加Taq聚合酶0.1 U，引物各2.5 pmol和dNTP 2.5 mmol。PCR扩增反应条件：92℃，15 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s，循环40次，72℃，5 min。(2)SAP反应：以0.3 U碱性磷酸酶除去剩余dNTP，37℃，40 min；83℃，5 min。(3)单碱基延伸：添加延伸引物5.4 pmol与50μmo的ldNTP和ddNTP混合物、Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，反应条件设置为：96℃，2 min；96℃，5 s；54℃，5 s；72℃，5 s，循环35次；72℃，3 min。(4)脱盐、上机：产物经树脂脱盐处理15 min，将检测样品转移到表面覆盖基质的SpectroCHIP芯片，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0软件分析，计数资料以%表示，组间比较采用卡方检验。采用Logistic回归分析疾病风险关联，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBC组与健康人血浆CTLA-4基因型和基因频率分布比较 经拟合优度卡方检验，两组人群CTLA-4基因rs231775、rs4675369和rs7599230位点的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡定律(P>0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs7599230位点等位基因和基因型频率与健康人比，无显著性差异(P>0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs231775位点基因型为GG型和等位基因G比率显著高于健康人，AA基因型和等位基因A比率显著低于健康人(P<0.05)；PBC患者CTLA-4基因rs4675369位点基因型为GG型和等位基因G比率显著高于健康人，AA基因型和等位基因A比率显著低于健康人(P<0.05，表1)。

表1 PBC患者与健康人血浆CTLA-4基因型和基因频率分布比较

2.2 CTLA-4基因型与PBC发生风险关联分析 应用非条件Logistic回归模型计算校正性别、年龄后的OR及95%CI，结果显示rs4675369位点GG基因型是影响PBC发生的危险基因型， rs231775位点GG基因型是影响PBC发生的危险基因型(表2)。

表2 血浆CTLA-4基因型与PBC发生风险关联分析

3 讨论

T淋巴细胞在人体免疫反应中具有重要的作用，是细胞免疫和体液免疫的重要环节，能在抗原刺激下活化产生功能各异的淋巴因子，调节体液免疫反应[10，11]。PBC患者体内包括多种类型的自身免疫性抗体，可导致机体肝脏以及其他脏器损伤，影响体液免疫反应[12]。相关研究[13]通过在动物体内注射抗CTLA-4单克隆抗体来阻断B7和CTLA-4之间的相互作用，发现可导致自身免疫性疾病动物病情加重，这一现象证实了CTLA-4在自身免疫性疾病发病过程中的关键性作用。CTLA-4也被称为CD152，是T细胞活化的负性调节分子，基因定位于人2q31-2q33，包括4个外显子和3个内含子，与CD28具有结构同源性。CTLA-4可抑制信号传导，终止细胞活化过程，其抑制作用一方面是通过与CD28分子竞争性与B7结合，阻滞T淋巴细胞激活的第二信号传递；另一方面是通过胞内域介导信号抑制细胞活化过程，从而达到T细胞活化的负向调控，促进T细胞凋亡的最终目的[14]。近些年来，人类开始广泛关注CTLA-4 基因多态性与疾病发生的关系，多项研究[15，16]也已经证实CTLA-4 的基因多态性与多种自身免疫性疾病之间存在密切关系。

研究表明[17]，CTLA-4基因中第一外显子rs231775位点的A等位基因具保护性，G等位基因则与自身免疫性疾病的发生有关。该位点基因多态性与T细胞表面CTLA-4表达有关，可降低sCTLA-4水平，削弱其免疫抑制功能，促进自身免疫性疾病的发生。本研究结果显示CTLA-4基因rs231775位点GG基因型是导致PBC发生的独立危险因素。当该基因位点发生A-G基因突变时，CTLA-4信号肽中苏氨酸与甘氨酸发生替换，导致CTLA-4蛋白亚细胞出现定位异常，新生肽链和分子伴侣间作用受到影响，使CTLA-4折叠过程出现异常，导致其发生功能变化。研究表明[18]伴自身免疫性疾病的患者，CTLA-4基因rs4675369位点GG基因型表达水平显著升高。本研究结果显示rs4675369位点多态性与PBC易感性有关，对比PBC患者与健康人群，PBC患者血浆CTLA4基因rs4675369位点G等位基因频率较高，GG基因型使PBC发生风险性增加了52.3%，与上述研究结果一致。rs4675369位点GG基因型可降低CTLA-4 转录水平，因此rs4675369位点GG基因型可弱化机体CTLA-4对T细胞激活的抑制，促使PBC的发生[19，20]。有研究显示CTLA-4基因rs7599230位点CC基因型是PBC易感基因型。但本研究比较PBC患者与健康人群基因型和基因频率分布无显著性差异，这可能与本次研究收集的样本量不足等因素有关，尚需要更大样本量的深入研究，了解其差异。对于CTLA-4基因多态性与其他人群的差异问题，需要更多层面的研究。不同性别、年龄、地域、基础疾病等人群PBC易感性是否存在差异，都需要进一步研究。为什么女性PBC发病率高，是否激素水平也有影响，均需阐明。