曲美他嗪对急性肝衰竭小鼠肝组织NOX2和NOX4表达的影响

汪 娅，罗婷婷，李 璨，赵文静，陆 爽

药物、酒精、嗜肝病毒、肝脏低灌注等诸多因素可造成肝细胞短时间内大规模死亡，肝功能丧失，发展为急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)，其病死率高达95%[1，2]。肝移植是目前明确唯一能挽救ALF患者生命的治疗方法。然而，限于供体的严重缺乏、巨额医疗费用和手术风险等原因，肝移植还不能广泛开展[3]。目前，尚未发现确实有效的干预靶点和特效治疗ALF的药物。曲美他嗪 (trimetazidine，TMZ)，其化学名称为1-(2，3，4-三甲氧苄基)-苯甲基哌嗪，是哌嗪类衍生物，首先作为抗心绞痛药物应用于临床，是治疗急慢性心力衰竭的重要药物[4，5]。该药具有抗氧化作用，增强清除超氧化物和羟基的能力，减少丙二醛(MDA)生成和氧自由基对内皮细胞的损害，保护细胞膜的稳定性[6]。近年来，有研究发现曲美他嗪可显著减轻缺血再灌注肝损伤并有促进肝细胞再生的治疗效果[7]。本研究应用D-氨基半乳糖联合脂多糖(lipopolysaccharide/D-galactosamine，D-Galn/LPS)诱导小鼠ALF模型，以盐酸曲美他嗪作为干预药物，从氧化应激改变方面探讨了曲美他嗪对ALF小鼠的保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 D-Galn购于美国Sigma公司，LPS购于北京索莱宝科技有限公司，兔抗鼠NOX2、抗NOX4 和抗GAPDH购于美国Abcam公司，检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(CAT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，盐酸曲美他嗪片购于施维雅(天津)制药有限公司，还原型谷胱甘肽片购于重庆药友制药有限公司。LEICA显微镜和OlympusBX41图像采集系统(日本OLYMPUS公司)，酶标仪(BIO-RAD公司)。

1.2 动物模型的制备 65只6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠购自重庆陆军军医大学实验动物中心，随机将小鼠分为6组，即对照组(n=10)、模型组(n=15)、小、中、大剂量曲美他嗪组(n=10)和还原型谷胱甘肽处理组(n=10)，给予对照组生理盐水腹腔内注射；在模型组，将D-Galn 500 mg 和LPS 50 μg加入无菌生理盐水10 ml，制备成50 mg D-Galn/5 μg LPS/ml溶液，取300 mg D-Galn/10 μg LPS.kg-1腹腔内注射；在小、中、大剂量盐酸曲美他嗪组，将盐酸曲美他嗪10 mg溶于无菌生理盐水10 ml，制备成1 mg/ml溶液，分别以5 mg.kg-1.d-1、10mg.kg-1.d-1和20 mg.kg-1.d-1灌胃，持续1 w后处理同模型组；将还原型谷胱甘肽片10 mg制备成1 mg/ml溶液，以20 mg.kg-1.d-1灌胃，持续1 w后处理同模型组。各组小鼠均在处理6 h后处死。从眼球静脉收集血液，分离血清。取部分肝组织，制备10%组织匀浆。取上清液。经门静脉灌注，收集各组相同部位肝组织，用低聚甲醛溶液固定48 h，制片。

1.3 肝组织 NOX2/4 mRNA水平和蛋白表达检测 采用RT-PCR法，取冻存的肝组织50 mg，抽提组织总RNA，加入逆转录试剂，逆转录成cDNA。取cDNA加入SYBR荧光染料和上下游引物，进行PCR扩增；在实验过程中严格设立内参照GAPDH；在指数区内设定参数，读取CT值，经负对数转化后，用目的片段与内参片段的比值作为该标本目的基因水平；采用Western blot法，提取各组肝组织总蛋白，用BCA法检测肝脏蛋白浓度，使各组蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液，煮15 min，使蛋白变性，各组取相同体积的蛋白样品，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭。然后，分别加入抗NOX2和抗NOX4，孵育过夜，次日用TBST清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育50 min，曝光，使用扫膜仪扫描并采图，并应用软件分析目的蛋白条带的灰度值。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学表现 与对照组比，模型组小鼠肝细胞坏死严重，炎症细胞浸润明显；与模型组比，中、大剂量曲美他嗪处理组小鼠肝组织病理学损伤均有所改善(图1)。

图1 各组小鼠肝组织病理学表现(HE，200×)A:对照组；B:模型组；C:谷胱甘肽处理组；D:小剂量曲美他嗪处理组；E:中剂量曲美他嗪处理组；F:大剂量曲美他嗪处理组

2.2 各组血清ALT和AST水平比较 与对照组比，模型组血清ALT和AST水平显著升高(P<0.05)；与模型组比，中、大剂量曲美他嗪处理组血清ALT和AST水平显著降低(P<0.05，表1)。

表1 各组血清ALT和AST水平比较

2.3 各组肝组织匀浆MDA和CAT含量变化 与对照组比，模型组MDA含量升高，而CAT含量降低(P<0.05)；与模型组比，中、大剂量曲美他嗪处理组MDA含量显著降低，而CAT含量显著升高(P<0.05，表2)。

表2 各组肝组织MDA和CAT水平比较

2.4 各组肝组织NOX2/4 mRNA水平比较 与对照组比，模型组NOX2/4 mRNA水平显著升高(P<0.05)；与模型组比，中、大剂量曲美他嗪处理组NOX2/4 mRNA水平显著减低(P<0.05，表3)。

表3 各组肝组织NOX2/4 mRNA水平比较

2.5 各组肝组织NOX2/4 蛋白表达量变化 与对照组比，模型组NOX2/4 蛋白相对表达量显著增强(P<0.05)；与模型组比，中、大剂量曲美他嗪处理组NOX2/4 蛋白相对表达量显著减弱(P<0.05，表4)。

表4 各组肝组织NOX2/4 蛋白相对表达量比较

图2 各组小鼠肝组织NOX2/4蛋白表达情况A:对照组；B:模型组；C:谷胱甘肽处理组；D:小剂量曲美他嗪处理组；E:中剂量曲美他嗪处理组；F:大剂量曲美他嗪处理组

3 讨论

ALF是一种罕见且严重的综合征，在没有已知潜在慢性肝病患者的肝脏受到急性打击后，正常肝功能迅速恶化，表现为黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病为特征，患者多因并发多器官衰竭而死亡，其病死率极高。氧化应激是指细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)过度产生, 内源性抗氧化防御功能减弱，致使两者之间不平衡，引起组织或细胞损伤的状态。氧化应激是许多肝脏疾病的发病机制，在肝脏疾病的发展过程中起着重要作用[8-11]。

LPS是革兰阴性细菌细胞内毒素的主要成分。有研究报道LPS可以诱导NOX激活[21]。同时，肝脏kuffer细胞中的吞噬型NOX(即NOX2)可被细菌产物(如LPS)激活产生大量的ROS[22]。 D-Galn是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，可造成肝细胞弥漫性坏死和炎症。有研究者使用Galn/LPS诱导大鼠ALF模型，观察到与对照组相比，ALF大鼠肝组织NOX4蛋白表达显著增加[23]。

曲美他嗪是一种游离脂肪酸氧化抑制剂。研究发现曲美他嗪抑制NOX2能改善糖尿病相关的心肌病[24]。本实验结果显示，曲美他嗪干预可减轻D-Galn/LPS诱导的ALF小鼠肝损伤程度，中、大剂量曲美他嗪灌胃小鼠血清ALT和AST水平下降，肝组织匀浆MDA含量降低，而CAT含量升高。同时，NOX2/4水平减低。以上结果表明曲美他嗪可能通过下调肝组织NOX2/4表达，减轻氧化应激损伤，改善D-Galn/LPS诱导的小鼠急性肝衰竭。本研究以盐酸曲美他嗪为干预药物，从NOX2/4介导的氧化应激方向探究了抗氧化剂对ALF的保护作用，进一步提供了对ALF发病机制的深入了解，期望对ALF的抗氧化治疗提供新的思路。本研究未在细胞水平进一步验证曲美他嗪下调肝组织NOX2/4表达的机制，后续将进行深入研究。