小檗碱靶向HDAC/H3K9ac/KLF4抑制棕榈酸诱导的HepG2脂肪变性体外实验研究*

李经纬，王子璇，王梦雨，黄瑞贤，信丰智，范建高，汪保灿

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)可以导致2型糖尿病、肝硬化和肝癌及其肥胖相关癌症等的发生[1-4]。小檗碱(berberine， BBR)是一种天然的异喹啉类生物碱，存在于小檗、黄连、黄柏等多种药用植物中。近年来有研究发现，BBR可以缓解NAFLD[5,6]，减轻NAFLD患者肝组织脂肪变，同时也可以改善胰岛素抵抗(IR)、治疗代谢综合征、降低胆固醇等。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDACs)是一类蛋白酶，在染色体的结构修饰和基因表达调控过程中发挥着重要的作用[7]。在高脂饮食诱导的NAFLD模型小鼠，可以通过抑制肝组织HDAC活性，使组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化(histone H3 lysine residue 9 acetylation，H3K9ac)显著增加，从而有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因转录[8]。H3K9ac水平升高可以通过促进过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α， PPARα)的活化，从而激活脂肪酸β氧化，缓解NAFLD病变[9]。BBR可以显著抑制葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)诱导的小鼠脾细胞HDAC活性，起到近似于HDAC抑制剂曲古菌素A(trichostatin A，TSA)的作用[10]。BBR也可以显著抑制人类肺癌细胞系A549细胞HDAC的表达[11]。Krüppel样因子4 (Krüppel-like factor4，KLF4)是一种锌指结构的转录因子，在NAFLD患者肝组织KLF4表达水平较正常人显著下降[12]。KLF4可以通过阻断Apelin信号通路抑制急性肝损伤时的肝细胞脂肪变性13]。KLF4表达增加抑制了游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)诱导的脂肪细胞炎症反应[14]。在白血病细胞K562和人食管癌细胞系KYSE150等细胞系H3K9ac水平增加可使KLF4表达水平显著增加[15]。本研究应用棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导HepG2细胞构建NAFLD细胞模型，观察了BBR对细胞HDAC1、H3K9ac、KLF4、SREBP-1c和PPARγ表达的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肝癌细胞株HepG2来自于美国模式菌收集中心(American type culture collection，ATCC)；BBR(Sigma公司)；PA(Sigma公司)；Lipofectmin 2000(Invitrogen公司)；抗-HDAC1 (武汉谷歌生物)；抗-H3K9ac(Abcam公司)；抗-KLF4(Proteintech公司)；抗- SREBP-1c(Proteintech公司)；抗- PPARγ(武汉谷歌生物)；pEX-3-HDAC1过表达质粒(Ov-HDAC1)和SiRNA-KLF4-1/2(上海吉玛基因)；油红O(Sigma公司)；检测TNF-α、IL-1β和IL-6 的ELISA 试剂盒(Solarbio公司)；EZ-ChIP试剂盒(Millipore公司)。

1.2 细胞培养 取HepG2细胞，随机分为对照组、模型组和药物干预组。以2×105接种于6孔板(2 ml/孔)，培养24 h，用200 μM PA刺激培养24 h。在BBR处理组，用完全培养基将20 mM BBR储存液配置成为20 μM BBR工作液。取HepG2细胞，以2×105接种于6孔板(2 ml/孔)培养24 h，弃去原培养基，加入20 μM BBR工作液2 ml，继续培养24 h。质粒和small interfering RNA转染：取HepG2细胞，以2×105接种于6孔板，培养24 h。随机分为HDAC1过表达质粒转染组(Ov-HDAC1)、空质粒转染组(Ov-NC)、SiRNA-KLF4-1转染组(SiRNA-KLF4-1)、SiRNA-KLF4-2转染组(SiRNA-KLF4-2)和SiRNA-NC转染组(SiRNA-NC)。在转染前，弃去6孔板中含有血清的培养基，用PBS冲洗1～2次，加入Opti-MEM 培养基(1500 μl/孔)。取Lipofectamine 2000转染试剂5 μl和质粒DNA 3 μg分别与opti-MEM培养基250 μl混合(使用同样的方法转染SiRNA)，混匀后静置10 min，将两者再混匀后静置20 min，在每个孔中加入混合液500 μl，培养6 h，更换完全培养基继续培养。

1.3 细胞蛋白表达检测 采用Western blot法，收集细胞，提取总蛋白，采用BCA法定量检测蛋白浓度。按照Western blot步骤对蛋白样品电泳和电转移，用5%牛奶封闭1 h，加入一抗，4℃孵育过夜。次日，加二抗，室温下孵育1 h，使用ECL发光试剂盒显色，进行显色、扫描、拍照，分析蛋白条带灰度。

1.4 HepG2细胞脂质沉积检测 使用油红O染色，在显微镜下观察细胞形态和细胞内脂滴。

1.5 细胞培养上清细胞因子检测 采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.6 细胞KLF4启动子区H3K9ac水平检测 采用CHIP-qPCR法，使用EZ-ChIP试剂盒裂解HepG2细胞，超声处理，将染色质切至200～700 bp长度，离心后取上清液10 μl作为Input，其余上清液用于之后的实验。将交联的DNA与抗H3K9ac抗体和阴性对照抗IgG抗体在4℃孵育过夜。加入NaCL使DNA去交联，使用蛋白酶K消化去除蛋白质，用纯化后的DNA用于PCR试验。所用的引物由上海生工生物有限公司合成：KLF4启动子上游引物序列为5′-GAACAGGCGGAAAGAGGC-3′，下游引物序列为5′-CAGGAGAATCGCTTGGACG-3′，GAPDH上游引物序列为5′-CTCCTGCACCACCAACTGCT-3′，下游引物序列为5′-GGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′。

2 结果

2.1 各组细胞HDACs和H3K9ac蛋白表达水平比较 PA处理显著提高了HepG2细胞HDAC1蛋白表达水平(P<0.001)，而降低了H3K9ac蛋白表达水平(P<0.001)；在PA诱导的HepG2细胞，BBR抑制了HDAC1蛋白的过量表达(P<0.01)，而显著提高了H3K9ac蛋白的表达水平(P<0.01，图1)。

图1 各组细胞HDAC1和H3K9ac蛋白表达比较与对照组比，***P<0.001；与模型组比，##P<0.01

2.2 转染HDAC1过表达重组质粒对HepG2细胞H3K9ac水平的影响 转染HDAC1过表达重组质粒显著增加了HepG2细胞HDAC1蛋白水平(P<0.001)，证实HDAC1过表达质粒转染成功。在PA诱导的HepG2细胞，加入Ov-HDAC1质粒显著降低了HepG2细胞H3K9ac水平(P<0.001，图2)。

图2 HDAC1过表达细胞H3K9ac水平变化A：转染HDAC1过表达质粒HepG2细胞HDAC1蛋白表达变化；B：转染HDAC1过表达质粒HepG2细胞H3K9ac水平变化;与Ov-NC组比，***P<0.001

2.3 BBR在PA诱导的HepG2细胞通过调节H3K9ac水平激活KLF4的表达 与对照组比，PA诱导的HepG2细胞KLF4蛋白表达显著降低(P<0.001)，而BBR或丁酸钠(一种HDAC抑制剂)处理后，HepG2细胞KLF4蛋白表达显著增加(P<0.01，图3A)。此外，CHIP-qPCR检测结果显示，BBR处理后KLF4启动子区H3K9ac水平显著增加(P<0.001，图3B)，提示BBR通过提高HepG2细胞H3K9ac水平激活KLF4的表达。

图3 各组细胞KLF4蛋白表达水平A：KLF4蛋白表达水平；B：两组细胞经抗H3K9ac抗体处理后KLF4启动子表达水平;与对照组比，***P<0.001；与模型组比，##P<0.01，###P<0.001

2.4 BBR在PA诱导的HepG2细胞通过激活KLF4减轻细胞脂质积聚 与SiRNA-NC处理组比，转染SiRNA-KLF4-1/2的HepG2细胞KLF4蛋白表达水平显著下降(P<0.01，图4A)；与对照组比，PA诱导加剧了HepG2细胞脂质沉积；与模型组比，BBR处理缓解了PA诱导引起的脂质沉积，而KLF4的沉默逆转了BBR对HepG2细胞脂质积累的影响(图4B)。

图4 沉默KLF4基因抑制了BBR对PA 诱导的HepG2细胞脂质沉积的保护作用A：转染SiRNA的HepG2细胞KLF4蛋白表达变化；B：各组HepG2细胞脂质沉积情况(油红O，100×);与SiRNA-NC组比，**P<0.01，***P<0.001

2.5 BBR在PA诱导的HepG2细胞通过激活KLF4改善炎症反应 与对照组比，PA诱导促进了HepG2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.001)，而BBR处理可以显著改善PA诱导引起的炎症因子分泌(P<0.001)。同样地，沉默KLF4逆转了BBR的这种改善作用(图5)。

图5 各组细胞培养上清细胞因子水平比较与对照组比，***P<0.001；与模型组比，###P<0.001；与药物干预组比，$$P<0.01，$$$P<0.001

2.6 BBR在PA诱导的HepG2细胞通过激活KLF4调控脂质代谢相关基因表达 与对照组比，PA诱导可以显著促进HepG2细胞脂质合成相关基因SREBP-1c表达(P<0.001)，同时降低脂质分解相关基因PPARγ表达水平(P<0.001)；与模型组比，BBR处理显著抑制SREBP-1c表达(P<0.001)，同时促进了PPARγ表达(P<0.001)，而沉默KLF4削弱了BBR对脂质代谢相关基因表达的调节作用(P<0.001，图6)。

图6 各组细胞脂质代谢相关蛋白表达水平比较与对照组比，***P<0.001；与模型组比， ###P<0.001；与药物干预组比， $$$P<0.001

3 讨论

PA是FFAs的一种，可刺激细胞炎症因子的产生，促进肝细胞的脂质积累。在本研究中，我们建立了经典的PA诱导的HepG2细胞脂肪变细胞模型，发现PA诱导的HepG2细胞脂质沉积显著增加，细胞培养上清TNF-α、IL-1β和IL-6水平也显著增加，证实NAFLD细胞模型构建成功。

越来越多的证据表明，BBR能保护肝脏功能。研究发现BBR可以通过激活Nrf2/HO-1和PPARγ信号通路减轻甲氨蝶呤诱导的肝损伤大鼠氧化应激和细胞凋亡。BBR也可通过抑制炎症反应和线粒体依赖性的细胞凋亡，保护急性肝衰竭(acute liver failure，ALF) 小鼠。在本研究，我们在体外应用BBR刺激PA诱导的HepG2细胞，结果发现BBR可以显著改善PA诱导的肝细胞脂质沉积，降低细胞促炎细胞因子水平，提示BBR可以在体外缓解PA诱导的HepG2细胞脂肪变。

HDACs是一类通过组蛋白和非组蛋白去乙酰化来调控转录过程的酶家族。HDAC1可以通过调控组蛋白H3K9ac水平在同型半胱氨酸介导的脂质代谢紊乱过程中发挥关键的作用。此外，预防心血管疾病的药物洛伐他汀通过降低HDAC1表达，使H3K9ac水平增加，从而抑制巨噬细胞的炎症反应。丁酸钠(一种HDAC抑制剂)可以通过降低HDAC 1蛋白表达使H3K9ac水平上升，进而促进PPARα的活化，减轻肝脂肪变。HDAC抑制剂还能诱导肠上皮细胞、心肌细胞和血管平滑肌细胞KLF4表达，而甲基硒酸(methylseleninic acid，MSA)可以通过提高KLF4启动子区H3K9ac水平进而激活KLF4的表达。KLF4的激活可能在缓解肝脂肪变方面发挥一定的作用。在本研究，我们发现PA诱导的HepG2细胞经BBR处理后，HDAC1表达下降，H3K9ac水平升高，而HDAC1的过表达抑制了H3K9ac水平，表明HDAC1对H3K9ac的表达有调节作用。本研究还发现，BBR通过调节H3K9ac水平来提高KLF4的表达，而沉默KLF4则逆转了BBR对PA诱导的HepG2细胞脂质沉积和炎症反应的保护作用，提示KLF4的激活参与了BBR对肝脂肪变的干预作用。