慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞Galectin-3基因水平对聚乙二醇干扰素α治疗应答的影响*

许政衡，黄 勇，柯海霞，李 南，马乙云

流行病学调查显示，全球约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，目前仍有2.5亿HBV携带者[1]。乙型肝炎慢性化的机制尚未完全明确，相关诊治指南建议应用聚乙二醇干扰素-α或长期给予核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)。相对于核苷(酸)类似物，聚乙二醇干扰素-α治疗CHB患者具有HBeAg血清学转换率高、停药复发率低、不易产生耐药性和病毒变异低等优势，但部分患者经α-干扰素治疗仍不应答[2,3]。治疗CHB的最终目标是最大限度地抑制HBV复制。半乳糖凝集素-3(galectin-3)参与机体细胞的黏附和凋亡、促进单核细胞向巨噬细胞分化、新生血管的形成等多种生物学活动，在维持HBV复制和促成HBV感染的活动中发挥重要的作用，与HBV感染的慢性化密切相关[4,5]。有研究[6]表明，血清Galectin-3水平与CHB和慢性丙型肝炎患者预后有关，可为疾病的临床治疗提供参考。免疫功能紊乱是CHB发病的重要病因之一，外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)参与机体的免疫功能，了解PBMCs的功能状态对指导治疗CHB患者具有重要的意义[7]。本研究检测了CHB患者PBMCs galectin-3水平及其α-干扰素治疗应答的影响，为临床治疗CHB患者提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2016年12月～2019年12月我院收治的CHB患者106例，男性62例，女性44例；年龄为26～61岁，平均年龄为(42.6±7.3)岁。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]诊断标准，纳入标准：(1)未接受过免疫调节剂和抗病毒治疗；(2)无精神类疾病，依从性较好，能够配合研究，连续使用聚乙二醇干扰素α-2a治疗48周。排除标准：(1)合并其他类型肝炎；(2)合并自身免疫性、遗传性肝病或药物性肝损伤；(3)合并严重的心肺功能损伤；(4)妊娠期或哺乳期女性。另选择同期健康体检者25例作为对照组，男17例，女8例；年龄为24～58岁，平均年龄为(41.7±6.8)岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 治疗方法 给予所有患者聚乙二醇干扰素α-2a(上海罗氏制药有限公司，国药准字J20070055)180 μg皮下注射，1次/w，连续治疗48 w。

1.3 疗效评价标准 参照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]标准评估疗效，血清转氨酶水平降至正常范围，血清HBV DNA水平阴转，血清HBeAg阳性患者发生或不发生血清HBeAg阴转，即为应答者，否则视为未应答。

1.4 PBMCs中galectin-3 mRNA检测 清晨空腹抽取静脉血10 mL，加入EDTA抗凝管，置于-70℃冰箱保存待检。取静脉血1 ml，与等量磷酸缓冲盐溶液混匀，加入Ficoll淋巴细胞分离液(中国科学院天津试剂厂)3 ml，离心，使用无菌一次性滴管小心吸取Ficoll分离液与血浆交界处的灰白色层(PBMCs)，加入EP管中再次离心，弃去上清，即获得白色细胞团(PBMCs)。采用Trizol法提取PBMCs全基因组RNA，再使用逆转录试剂盒(FINNZYMES公司)逆转录为cDNA，进行PCR扩增，扩增引物由上海生工生物公司合成，Galectin-3正、反向引物序列分别为 5’-GCGGAAATGGCACAATT-3’和5’-CTTGAGGGTTTGGGTTTCCA-3’，PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳加以验证，计算Galectin-3基因相对水平，采用2-△△Ct表示。

1.5 PBMCs中galectin-3蛋白检测 采用Westem blot法检测，取外周血，以RIPA裂解液裂解，离心后取上清液，以BCA法测定蛋白浓度。取PBMCs总蛋白，电泳分离，经硝酸纤维素膜转移，0.1%丽春红染色，使用适量的TBST缓冲盐溶液在转移脱色床上洗膜3次，每次15 min，再以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，加入第一抗体(美国Millipore公司)，室温震荡孵育1 h，再与第二抗体(美国Millipore公司)结合，作用1 h，以二氨基联苯胺(DAB)显色法进行显色并摄像。

1.6 血清检测 使用美国贝克曼库尔特公司生产的AU5800全自动生化分析仪检测血生化指标；采用实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA水平(上海恪敏生物)。

2 结果

2.1 疗效情况 在治疗24 w，本组CHB患者应答27例(22.6%)；在治疗48 w，应答44例(67.0%)。

2.2 不同应答患者血生化和HBV DNA 水平比较 在入组时，不同应答组血清AST、ALT、TBIL和HBV DNA水平无显著性差异(P>0.05，表1)。

表1 不同应答组血生化和HBV DNA 水平比较

2.3 不同应答组PBMCs galectin-3基因及其蛋白表达水平比较 24 w应答患者PBMCs galectin-3基因及其蛋白表达水平显著高于48 w应答、不应答或健康人(P<0.05)；48 w应答患者PBMCs galectin-3 mRNA水平显著高于不应答组或健康人(P<0.05，表2)。

表2 不同应答组PBMCs Galectin-3 mRNA及其蛋白表达比较

3 讨论

聚乙二醇干扰素-α为常用的抗病毒治疗的一线药物，其治疗疗效可能会受到病毒基因型和宿主等因素的影响。目前，仍存在部分患者经聚乙二醇干扰素-α治疗并不产生应答或不能获得完全应答，原因尚不明确[9]。CHB发病机制可能涉及Treg细胞与效应T细胞之间的免疫失衡，并与HBV感染慢性化有关。细胞免疫应答的活力和强度可以决定HBV感染是否是被清除或是持续，免疫应答的减弱可能导致HBV很难被免疫系统清除，使HBV感染慢性化，转变为持续感染。因此，机体免疫状态对α-干扰素治疗CHB患者的结局具有重要的影响[10,11]。

Galectin-3是半乳糖凝集素家族的重要成员之一，广泛存在于细胞质、细胞膜和细胞外基质中，其生物学功能复杂，参与调控细胞黏附、迁移、增殖、凋亡和炎症反应等过程[12]。既往临床对于galectin-3的研究主要集中于参与癌症发生机制方面，结果表明galectin-3可与相应配体结合影响细胞的生长、凋亡、分化和新生血管形成等过程，且可能成为癌症治疗的潜在靶点[13]。在肝癌方面的研究[14]表明，galectin-3表达后细胞增殖能力下降，并提示肝损伤的存在，影响患者的治疗预后。还有针对肝癌和CHB患者的相关血清学研究[15]发现，galectin-3是鉴定HBV相关肝癌的潜在生物标志物，能够提高临床诊断的效能，表明galectin-3在肝脏疾病的发生、发展和治疗预后方面发挥着重要的作用，而位于细胞内的galectin-3具有抑制细胞凋亡作用，其抑制细胞凋亡作用可能影响HBV复制和HBV感染过程，从而对临床肝脏疾病治疗产生影响[16]。此外，galectin-3还被证实与肝细胞再生有关，且极有可能是通过激活调节肝细胞再生过程中的信号通路Wnt/β-catenin 通路实现对肝细胞再生的调节，从而对肝脏疾病的治疗产生影响[17,18]。PBMC主要包含淋巴细胞和单核细胞，是固有免疫和适应性免疫应答的共同参与者。PBMCs表达的相关因子与机体免疫应答的启动有关。galectin-3基因表达能够促进单核细胞向巨噬细胞分化，在肝脏组织，PBMCs发挥抗原递呈作用，激活体内免疫应答系统，对HBV的复制发挥抑制作用，实现抗病毒功能[19,20]，而galectin-3表达对机体清除HBV的影响可能会对治疗CHB患者的疗效产生影响，但目前关于这方面的临床研究仍较少。基于此，本研究分析了CHB患者外周血单个核细胞galectin-3表达对α-干扰素治疗应答情况的影响，结果显示，本组治疗24 w应答率为22.6%，治疗48 w应答率为67.0%。应用聚乙二醇干扰素-α治疗CHB患者仍存在部分患者不产生应答或不能获得完全应答的现象。分析不同应答情况患者外周血单个核细胞galectin-3表达情况发现，在治疗24 w时，应答组患者外周血单个核细胞galectin-3基因及其蛋白表达水平相对于此时未应答的、在治疗48 w时才应答组和始终未应答组患者均显著升高，而在治疗48 w时，应答组患者外周血单个核细胞galectin-3基因及其蛋白表达水平也显著高于不应答患者。在聚乙二醇干扰素-α治疗CHB患者过程中，应答者机体外周血单个核细胞galectin-3基因及其蛋白均呈高表达，高表达的galectin-3基因及其蛋白在机体发挥抗病毒作用过程中可能起了关键作用，进一步表明聚乙二醇干扰素-α可能通过上调galectin-3基因及其蛋白表达发挥抗病毒作用的，但具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，CHB患者外周血单个核细胞galectin-3基因及其蛋白表达水平与聚乙二醇干扰素α治疗疗效密切相关。galectin-3基因及其蛋白均高表达提示患者对治疗应答，但本研究分析galectin-3基因及其蛋白表达情况应用的数据为相对表达量，且观察时间点较少，在后续研究应考虑采取多点采样检测以获取更为准确地galectin-3基因及其蛋白表达水平资料，动态分析galectin-3基因及其蛋白表达在CHB患者接受α-干扰素治疗过程中的变化。另外，我们并不知道肝组织galectin-3基因及其蛋白表达变化的规律，它们与肝组织炎症、纤维化和病毒载量的关系等，都需要认真研究。在α-干扰素治疗过程中，可观察的项目比较多，如何整合有价值的指标，联合检测，可能对更好地预测抗病毒治疗的效果有帮助。深入分析α-干扰素通过调节galectin-3基因及其蛋白表达发挥抗病毒作用的具体机制也很有必要。