液相色谱串联质谱内标法测定黑鱼中氧氟沙星残留量的不确定度评定

黄璐瑶 李澍才 李道霞 魏宇涛 余晓琴

四川省食品检验研究检测院 四川成都 610097

黑鱼，学名乌鳢，属鲈形目、鳢科，又名乌鱼、才鱼等，是生长快、分布广、产量大的淡水名贵经济鱼类[1]。喹诺酮类化合物是一类具有1,4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸结构的人工合成抗生素[2]，可作用于DNA拓扑异构酶进而干扰DNA复制，导致染色体受损，对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均有明显抑制作用[3～5]。因其具有快速杀菌、抗菌谱广、组织渗透性强、高效低毒、价格低廉、与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点[6～9]，广泛应用于人类和动物感染性疾病的防治工作[10，11]。氧氟沙星属于第三代喹诺酮类药物，曾在畜牧和水产养殖业中用于预防和治疗畜禽的细菌性感染及支原体病，具有良好效果[12，13]。但由于药物本身特性及滥用药物现象的存在，导致喹诺酮类化合物及其代谢物在受体动物中残留、蓄积，并通过食物链富集最终进入人体，引起食用者肠道菌群失衡或产生远期毒性作用及潜在“三致”(致畸、致癌、致突变)作用[14，15]。因此喹诺酮类化合物残留问题越来越引起人们重视。目前中国、美国、欧盟等国家及联合国粮农组织等均已对喹诺酮类化合物的使用及限量做出明确规定。我国农业部公告第2292号[16]中规定停止生产、使用包括氧氟沙星在内的4种喹诺酮类化合物原药、酯及其制剂。

测量不确定度，简称不确定度，是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[17]，是衡量测定结果准确性和可靠性的重要参数[18]。不确定度数值直接反映检测质量高低，是判定检测结果可靠性的重要参考依据。由被测量值和被测量值分散性的值(即不确定度)组成的定量分析结果，既增加检测方法和结构的可信度，又便于比对不同实验室的分析结果，是食品检验工作不可或缺的一部分[19，20]。RB/T 216-2017《检验检测机构资质认定能力评价食品复检机构要求》[21]亦规定了食品复检结果应包括测量不确定度。

本研究参考农业部1077号公告-1-2008《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》[22]，采用液相色谱-串联质谱法，以D5-诺氟沙星为内标对鱼肉中氧氟沙星残留量进行测定，并根据JJF 1059.1-2012《不确定度评定与表示》[17]、CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[23]、JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[24]等测量不确定度的方法，建立数学模型，分析实验过程中的不确定度来源及各分量对测定结果的影响，对其进行不确定度评定。内标法常用于样品中低含量化合物的定量分析，在一定程度上可消除前处理操作、色谱条件微小变化等带来的误差及基质效应干扰，可有效提高定量的准确性，同时起到质量控制作用。本研究为实验室质量控制及其他类似测定的正确评价，提供科学可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪1260/6460，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平XS105DU，梅特勒-托利多公司；

高速离心机HERAEUS MULTIFUGE X3R，美国Thermo Fisher Scientific公司；

涡旋混合仪IKA©MS 3，德国IKA公司。

1.2 样品与试剂

阴性/阳性黑鱼样品；

氧氟沙星标准品(纯度99.3%，批号：B0004971，北京曼哈格生物科技有限公司)；

D5-诺氟沙星(纯度99.2%，批号：272238，WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)；

甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸(色谱纯，美国Fisher Chemical公司)；

无水硫酸钠(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

参考农业部1077号公告-1-2008[22]进行。即精密称取粉碎混匀阳性黑鱼样品约5g，置50mL聚丙烯离心管中，加入60μL内标工作溶液，涡旋混合30s，避光放置10min。加入10g无水硫酸钠，涡旋混匀，再加入20mL1%甲酸-乙腈溶液，涡旋混匀1min，超声提取10min，8 000r/min离心5min，将上清液收集置50mL离心管中；残渣加入20mL1%甲酸-乙腈溶液，重复提取一次，合并2次提取液。加入10mL乙腈饱和正己烷，涡旋1min，静置分层，弃去上层正己烷。重复上述步骤一次，乙腈层于40℃下氮吹至近干，精密加入2mL 0.1%甲酸-乙腈(9-1，V/V)溶液涡旋使残渣溶解，过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析测定。

1.3.2 标准溶液的配制

精密称取11.36mg氧氟沙星标准品置于10mL容量瓶中，加0.2mL甲酸溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得氧氟沙星标准储备液。精密吸取上述标准储备液90μL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得氧氟沙星标准工作液。精密称取D5-诺氟沙星标准品11.72mg置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液。精密量取上述内标储备液1mL置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得内标工作液。

1.3.3 标准系列溶液的制备

取粉碎混匀阴性黑鱼样品(5g/份)，按样品前处理制备空白基质。分别精密加入上述混合标准工作液4、10、20、40、100、200μL和内标工作溶液30μL，氮吹至干后，精密加入1mL空白基质充分溶解，即得标准工作曲线溶液，供液相色谱串联质谱分析，内标法定量。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 2 Super C18(2μm,2.1×75mm)。

流速：0.25mL/min。

柱温：35℃。

进样量：2μL。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 质谱条件

离子源：电喷雾(ESI)，采用正离子模式。

毛细管电压：4.0kV。

离子源温度：320℃。

去溶剂温度：300℃。

锥孔气流(N2)流速：7L/min。

去溶剂气流(N2)流速：7L/min。

碰撞气压：20psi。

监测模式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)。

其他质谱参数见表2。

表2 质谱参数Table 2 Mass spectrometric parameters

1.4 数据处理

采用美国Agilent Technologies Inc.的Mass Hunter Workstation Sorfware 06.00软件进行分析处理，Microsoft Office Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立

根据农业部1077号公告-1-2008[22]，并参考CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[23]，测定鱼肉中氧氟沙星含量(μg/kg)，可表示为公式(1)。

(1)

式中：X—样品中氧氟沙星残留量(μg/kg)；

c—标准曲线回归方程计算得到样品溶液中氧氟沙星浓度(ng/mL)；

n—稀释倍数；

m—样品称样量(g)。

2.2 不确定度来源分析

根据样品前处理、检测过程及对数学模型的分析[25～28]，影响鱼肉中氧氟沙星残留量测定的不确定度因素有：A类不确定度，来源包括标准曲线拟合urel(A1)、测量重复性urel(A2)、方法回收率urel(A3)；B类不确定度，来源包括标准溶液的配制urel(B1)、样品前处理urel(B2)、仪器测定urel(B3)。

2.2.1 A类不确定度评估

2.2.1.1 标准曲线拟合引入的不确定度urel(A1)

本研究采用内标法定量。对标准系列溶液进行测定，以氧氟沙星与内标D5-诺氟沙星浓度比值为横坐标，峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。氧氟沙星标准曲线回归方程为Y=0.120895X-0.015397。标准曲线产生的不确定度源于标准曲线残差的标准偏差SR，计算公式(2)。

(2)

其中Y为实测各标准点氧氟沙星峰面积与内标峰面积比值，Y'为标准曲线拟合氧氟沙星峰面积与内标峰面积比值。残差为Y和Y' 之差的绝对值|Y-Y' |。氧氟沙星标准曲线残差计算结果见表3。n为标准系列溶液测定次数，n=6。经计算，SR为0.06602。

表3 氧氟沙星标准曲线残差计算表(n=6)Table 3 Calculation table of standard curve residuals of Ofloxacin

标准曲线拟合引入的标准不确定度根据公式(3)。

(3)

其中，a为斜率；p为单份样品测定次数p=1；

ci为标准系列溶液各点质量浓度(ng/mL)。

(4)

(5)

2.2.1.2 重复测定引入的不确定度urel(A2)

(6)

由此，由重复测定引入的相对不确定度公式(7)。

(7)

2.2.1.3 回收率校正因子引入的不确定度urel(A3)

在实验过程中，由于人员操作、所用器具和设备等原因，样品处理后氧氟沙星含量会有所改变。本研究采用向不含氧氟沙星的阴性黑鱼样品加入与阳性黑鱼样品含量相当浓度水平的标准物质进行检测，定容体积2mL，测定结果和回收率如表4所示。计算平均回收率标准偏差公式(8)。

表4 加标回收率测定结果Table 4 Result of standardaddition recovery rate

(8)

因此，由回收率引起的相对标准不确定度urel(A3)=0.01157。

故本方法A类不确定度根据公式(9)。

(9)

urel(A)为0.01956。

2.2.2 B类不确定度评估

2.2.2.1 标准溶液引入的不确定度urel(B1)

标准物质引入的不确定度urel(B1.1)：根据氧氟沙星标准物质证书，该氧氟沙星标准物质纯度99.3%，扩展不确定度2.0%(k=2)，按正态分布，则：

(10)

(11)

(12)

标准系列溶液配制过程引入的不确定度urel(B1.4)：在实验过程中，仅加入内标体积这一过程可对最终结果造成影响，因此，关于内标，本研究仅考虑配制标准系列溶液过程中加入内标体积使用器具引入的不确定度，不考虑内标称样量、纯度等。配制标准储备溶液和工作溶液所用容量瓶具经鉴定均为A级，按照JJG 196-2006[24]，属于三角形分布，用最大允差计算不确定度，如表5所示。使用移液枪按校准证书计算不确定度，如表6所示。

表5 标准溶液配制过程中使用玻璃量具引入的不确定度Table 5 Uncertainty of volumetric glassware in the preparation of standard solution

表6 标准溶液配制过程中使用移液枪引入的不确定度Table 6 Uncertainty of pipettor in the preparation of standard solution

经计算，urel(B1.4)=0.01346。

(13)

2.2.2.2 样品前处理引入的不确定度urel(B2)

加入内标溶液引入的不确定度urel(B2.2)：用100μL移液枪吸取60μL D5-诺氟沙星内标工作液，根据校准证书测量不确定度为0.30μL，k=2，则：urel(B2.2)=0.002500。

(14)

则样品前处理引入的不确定度：

urel(B2)=

(15)

2.2.2.3 液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度urel(B3)

查所使用的液相色谱-串联质谱仪校准证书，该仪器测量结果的相对不确定度urel=5%，k=2，则该仪器引入的相对标准不确定度为：

(16)

故本方法B类不确定度根据公式：

(17)

urel(B)为0.03041。

2.3 合成不确定度和扩展不确定度

2.3.1 合成相对标准不确定度

表7 测量不确定度分量Table 7 Uncertainty components of measurement

(18)

2.3.2 扩展不确定度及结果报告

按照农业部1077号公告-1-2008[22]保留三位有效数字，根据JJF 1059.1-2012[17]，取置信区间P=95%，包含因子k=2，测定样品氧氟沙星含量为16.6μg/kg。根据公式(19)：

U=urel(X)×2×16.6=1.2μg/kg

(19)

最终结果可表示为氧氟沙星含量X氧氟沙星=(16.6±1.2)μg/kg。

3 结论与讨论

本研究建立了液相色谱-串联质谱内标法测定黑鱼中氧氟沙星的不确定度评定数学模型。内标法的应用，在一定程度上可消除前处理操作、色谱条件微小变化等带来的误差及基质效应干扰，可有效提高定量的准确性，起到质量控制作用。建立的数学模型可用于查找检测过程中对检测结果产生影响的因素，为评价测定方法及结果的准确性提供了可靠依据。

根据数据分析影响不确定度的因素包括标准曲线拟合、标准物质、样品前处理、测量重复性等。结果表明，仪器测量结果、标准溶液的配制和标准曲线拟合引入的不确定度最大。因此，建议实验室应定期开展相关仪器的校准检定及期间核查。同时为控制标准系列溶液配制过程中产生的误差，应严格控制实验过程，使用较高纯度标准品、高校准级别的容量瓶及校准合格的移液器，根据实际需求选择合适浓度的标准曲线范围。另外，还应提高实验人员操作规范性和熟练度，增加平行样及平行测定次数，尽可能减小检测过程中带来的不确定度，从而提高测定结果的科学性、准确性和可靠性。本模型的建立为实验室质量控制及其他类似测定的正确评价提供科学可靠的依据。