不同香辛料对亚硝酸盐清除作用的研究

付 丽 庄军辉 高雪琴 郝修振

河南牧业经济学院食品与生物工程学院 河南郑州 450046

近年来，关于亚硝酸盐的食品安全事件频繁发生，给消费者的身体健康和安全带来了很大威胁。在肉制品加工中，亚硝酸盐是最常使用的一种食品添加剂[1]，能使肉呈现诱人的粉红色，其发色原理是肉中存在的肌红蛋白与亚硝酸盐结合生成鲜艳、亮红色的亚硝基肌红蛋白，对保持肉制品的色泽有着重要作用[2，3]；同时，其对肉制品的口感、风味、组织状态都发挥着重要的作用。另外，亚硝酸盐对肉毒梭状芽胞杆菌的抑制作用是不可替代的[4]。因此，亚硝酸盐是肉制品加工中重要的发色剂、抗氧化剂和防腐剂，对肉制品的色、香、味及安全性均具有重要的作用。但亚硝酸盐在肉制品加工中的残留能产生亚硝胺和亚硝基酰胺等致癌物质[5，6]，所以关于亚硝酸盐的食品安全问题已成为肉制品加工生产中急需要解决的问题。国家食品安全标准明确规定了肉制品中亚硝酸盐的最大使用量不得超过0.15g/kg，还规定亚硝酸盐残留量(以亚硝酸钠计)不能超过30mg/kg[7]。另外，世界卫生组织和食品科学委员会规定亚硝酸盐的每日允许摄入量为0～0.06mg/kg[8]。随着人们对于绿色和清洁标签食品的强烈追求，有关亚硝酸盐天然替代物质的研究非常多[9，10]，但到目前为止还没有找到理想的亚硝酸盐替代物[11]，采用添加一些天然成分降低亚硝酸盐的残余量则是提高肉品安全的直接途径，因此关于降低肉制品中亚硝酸盐残余量的研究成为了众多学者关注的课题。

学者们目前已经发现了许多物质都对亚硝酸盐有一定清除作用，包括抗坏血酸(VC)及多种天然植物提取物，原因是这些植物都含有比较丰富的VC、类黄酮和酚类等还原性物质[12]。Deda[13](2007)等研究得出低浓度的亚硝酸盐与12%的番茄酱混合腌制香肠能达到最佳的发色效果，能减少肉制品中亚硝酸盐残留量。Li[14](2013)等研究发现绿茶多酚、葡萄籽多酚和抗坏血酸对香肠发酵过程中残留的亚硝酸盐和亚硝胺都有显著的清除效果。

现代科学研究表明，香辛调味料具有清除亚硝酸盐功能，可有效清除亚硝酸盐[15]。罗思玲[16](2019)等研究发现生姜残渣中黄酮浓度0.1mg/mL时对亚硝酸盐具有一定清除作用，清除率可达50.25%。李玉邯[17](2016)等研究发现大蒜提取液对香肠和熟肉中亚硝酸盐清除率分别可达85%和92%。李品艾[18](2011)等研究花椒水浸提液对亚硝酸盐的清除作用较为明显。张强[19](2015)等研究了10种香辛调味料对亚硝酸盐的清除能力并发现桂皮提取液的清除效果最好。李文龙[20](2020)研究得出竹叶提取物、茶多酚、迷迭香提取物、葡萄籽提取物和甘草提取物均能够不同程度地降低火腿中亚硝酸盐残留量。李佳栋[21](2017)等研究发现桂皮、丁香和花椒提取液对风干肠中的亚硝酸盐具有很好的清除作用且还能有效阻断有毒物质N-亚硝胺的生成。这些研究都说明了天然物质对亚硝酸盐有着一定的清除能力，尤其是香辛料提取物中存在的某些天然成分对于亚硝酸盐都有着一定的清除能力。

本试验选用八角、桂皮、生姜3种香辛料，分别采用水浸提法、醇浸提法、超声-水浸提法、超声-醇浸提法4种方法进行浸提，模拟体外胃液环境下对亚硝酸盐进行清除作用的研究，筛选出每种香辛料的适宜浸提方法；研究3种香辛料不同添加量对亚硝酸盐清除效果，分别得出其适宜的添加量，最终优化出3种香辛料清除亚硝酸盐的适宜配比。通过本试验的研究开发出一种亚硝酸盐天然复合清除剂，可为其在肉品加工中的应用提供一定的数据指导，从而大大减少亚硝酸盐在肉制品中的残留量，提高肉制品的安全性。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

八角、生姜、桂皮，购于郑州调味品市场；

亚硝酸钠，为食品级，由河南牧业经济学院畜产品研究室提供；

柠檬酸、氢氧化钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺，均为分析纯，购于天津永大化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

超声波细胞粉碎机JY96-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司；

紫外可见分光光度计BluseStarB，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；

多功能粉碎机GX-04，浙江省永康市昌发工具厂；

电子天平FA224，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

双功能水浴恒温振荡器SHA-B，金坛市杰瑞尔电器有限公司；

电热恒温培养箱DHP-080，郑州生元仪器有限公司；

循环水真空泵SHZ-Ⅲ，巩义市英峪予华仪器厂；

酸度计PHSJ-3F，上海仪电科学仪器股份有限公司。

2 试验方法

2.1 香辛料预处理

分别称取八角、桂皮、生姜3种香辛料各100g。用粉碎机将桂皮、八角粉碎至粉状，备用；将生姜洗净后去皮、切碎，备用。

2.2 香辛料的浸提及提取液的制备

采用水浸提、醇浸提、超声-水浸提、超声-醇浸提4种方法对八角、桂皮、生姜3种香辛料进行有效成分的浸提。

2.2.1 水浸提法

准确称取3种处理好的香辛料各50g，放入250mL带塞三角瓶中，加150mL蒸馏水，在40℃的水浴中振荡浸提1h，用滤纸过滤后取滤液，浓缩至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏备用。

2.2.2 醇浸提法

准确称取3种处理好的香辛料各50g，放入250mL带塞三角瓶中，加150mL无水乙醇，在40℃的水浴中振荡浸提1h，用滤纸过滤后取滤液，浓缩至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏备用。

2.2.3 超声-水浸提法

准确称取3种处理好的香辛料各50g，放入250mL带塞三角瓶中，加150mL蒸馏水，放入超声波细胞粉碎机中，频率为25KHz，功率为300W，在40℃的水浴中超声浸提25min，用滤纸过滤后取滤液，浓缩至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏备用。

2.2.4 超声-醇浸提法

准确称取3种处理好的香辛料各50g，放入250mL带塞三角瓶中，加150mL无水乙醇，放入超声波细胞粉碎机中，频率为25KHz，功率为300W，在40℃的水浴中超声浸提25min，用滤纸过滤后取滤液，浓缩至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏备用。

2.3 不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐的清除效果

2.3.1 3种香辛料提取方法的筛选

吸取不同提取方法制备的八角、桂皮、生姜3种香辛料提取液(浓度为1g/mL)各1mL，分别置于50mL比色管中，加水至刻度，混匀后进行亚硝酸盐清除率的测定，筛选出3种香辛料的适宜提取方法。

2.3.2 不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐清除的效果

吸取适宜方法提取的生姜和桂皮(浓度为1g/mL)提取液1、2、3、4、5mL，分别置于50mL比色管中，加水至刻度，混匀；进行亚硝酸盐清除率的测定，研究不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐的清除效果，以确定其适宜的添加量。

2.3.3 3种香辛料提取液配比的优化

在单因素试验确定的3种香辛料提取液添加量的基础上，将3种香辛料提取液复合研究其协同对亚硝酸盐的清除效果，进行三因素三水平正交试验，因素水平表见表1。按不同配比分别吸取3种香辛料提取液(浓度为1g/mL)置于50mL比色管中，加水至刻度，混匀，以亚硝酸盐清除率为测定指标，优化出八角、桂皮、生姜3种香辛料协同配比。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Level table of orthogonal test factors

2.3.4 亚硝酸盐清除率的测定

亚硝酸盐清除率的测定方法依照赵二劳[22](2006)等的研究方法并稍做改动。分别取各种提取液10mL于50mL容量瓶中，然后再加入配制好的25mL的pH值为3.0柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液，再加入100mg/kg的NaNO2溶液5mL，最后用蒸馏水定容至刻度，并在恒温箱内，37℃恒温1h。然后用移液枪各吸取1mL反应液于25mL具塞试管内，再分别加入质量分数为2mL 4g/L的对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5min后各加入质量分数为2mL 2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min。用分光光度计在540nm处测吸光度，分别用相应浓度相同用量的提取液做空白试验。亚硝酸盐消除率按公式(1)计算。

亚硝酸盐清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100%

(1)

式中：A0为加入相应提取液空白试验的吸光度；Ax为加入不同浓度提取液时的吸光度。

2.3.5 数据处理与分析

每个试验平行进行3次，结果表示为平均数±标准差。采用SigmaPlot12.5绘制图表，采用SPSS17.0进行显著性分析，显著性水平0.05。

3 结果与讨论

3.1 3种香辛料提取方法的筛选

不同方法提取香辛料提取液的亚硝酸盐清除率变化见图1。

由图1可见，针对八角提取物对亚硝酸盐清除率来讲，醇提法、超声-醇提法、超声-水提法无显著差异且均显著优于水提法(p<0.05)，说明超声处理与醇提法协同效果无差异，而超声处理与水协同效果明显。原因可能是八角中存在对亚硝酸盐有清除作用的成分与水相比更容易溶于无水乙醇中，醇提取效率比较好，超声波作用不明显，而水提取效率低，使用超声处理能有效提高其提取率。针对桂皮提取物对亚硝酸盐清除率来讲，醇提法明显优于水提取法、超声-水提取法(p<0.05)，略高于超声-醇提取法(p>0.05)，其原因可能由于桂皮中对亚硝酸盐具有清除作用的物质易溶于无水乙醇中，使用超声波辅助会对这种物质具有一定的破坏作用，降低其清除作用。针对生姜提取物对亚硝酸盐清除率来讲，醇提取和超声-醇提效果差异不显著且显著低于水提取和超声-水提(p<0.05)，原因可能是醇会破坏生姜中有效成分，使用超声处理也会在一定程度上起破坏作用。综上所述，在4种提取方法中，八角、桂皮以醇提取法效果较好，生姜以水提取法效果较好。

图1 不同方法提取香辛料提取液的亚硝酸盐清除率变化Fig. 1 Changes in nitrite removal rate of spices extracted by different methods注：小写字母不同表示同一香辛料不同提取方法间亚硝酸盐清除率差异显著(p<0.05)。

3.2 不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐清除效果

不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐清除效果见图2。

图2 不同添加量香辛料提取液的亚硝酸盐清除率变化Fig. 2 Changes of nitrite scavenging rate of spices with different supplemental levels注：小写字母不同表示同一香辛料提取液对亚硝酸盐清除效果差异显著(p<0.05)。

由图2可见，随着桂皮和生姜提取液添加量的增多，其对亚硝酸盐的清除效果呈上升趋势，而八角提取液的亚硝酸盐清除效果随其添加量的增多呈下降趋势。八角提取液添加量为1mL时，其亚硝酸盐的清除率为52%，原因是八角提取液中的茴香醛具有一定的抗氧化性[23]，可与亚硝酸酸盐发生某种反应使用消除；当添加量为2mL时，其亚硝酸盐清除率显著下降(p<0.05)。当桂皮提取液添加量在1～4mL时，其亚硝酸盐的清除率差异显著(p<0.05)，其值从65.74%升至86.53%，可能是桂皮提取液中含某种物质(如乙酸桂皮酯、乙酸苯丙酯、鞣质等)能与亚硝酸盐发生氧化还原反应从而降低其残留量[24]；当添加量达到5mL时，其亚硝酸盐的清除率变化不显著(p>0.05)。生姜提取液添加量为4mL时，其亚硝酸盐清除率显著高于添加量为3mL时的亚硝酸盐清除率(p<0.05)，原因是生姜提取液中含有愈创木酚[25]，同样具有一定的抗氧化作用；当生姜提取液添加量为5mL时的亚硝酸盐清除率增加并不显著(p>0.05)。因此，经不同添加量的香辛料提取液对亚硝酸盐清除效果研究，筛选出3种香辛料提取液适宜添加量分别为：八角添加量1mL，桂皮添加量4mL，生姜添加量4mL。

3.3 香辛料进行复配后对亚硝酸盐清除率的变化

正交试验结果及极差分析见表2。

由表2所见，由极差分析可知，八角、桂皮、生姜对亚硝酸盐清除率影响的主次关系为：C>B>A，其中生姜的影响最大，桂皮次之，影响最小的为八角。并得出最优组合配比为A3B3C3，即浓度为1g/mL的八角、桂皮及生姜提取液的复合添加量分别为2、4mL和4mL，三者添加配比为1∶2∶2。

3.4 验证试验

按上述优化得到的3种香辛料提取液最优组合配比A3B3C3,用于模拟体外胃液环境下对亚硝酸盐清除验证试验，以亚硝酸盐清除率为测定指标，分别做3组平行试验，得出其亚硝酸盐的清除率为88.71%，高于正交试验表2中亚硝酸盐清除率88.55%的最高组合A3B3C2，说明验证试验结果具有可靠性。

4 结论

香辛料多为药食两用植物资源，中国是世界上香辛调味料主要生产国和出口国，研究天然香辛料对亚硝酸盐的清除效果，具有得天独厚的资源优势且安全有效。本试验采用八角、桂皮、生姜这3种香辛料作为清除剂，分别采用水提法、醇提法、超声-水提法、超声-醇提法这4种方法进行其有效成分的提取并浓缩。在模拟体外胃液环境下对亚硝酸盐进行清除作用的研究，以亚硝酸盐清除率为考察指标，得到八角、桂皮的最适提取方法为醇提法，而生姜的最适提取方法为水提法；以最适方法对香辛料进行提取并浓缩，分别取1、2、3、4、5mL配成同体积溶液，分别研究3种香辛料不同添加量对亚硝酸盐清除效果，得出八角添加量为1mL、桂皮添加量为4mL、生姜添加量为4mL时清除效果最优。最后进行正交试验优化出浓度为1g/mL的八角、桂皮及生姜提取液适宜的复合添加量分别为2、4mL和4mL时对于亚硝酸盐的清除有着较好的效果，清除率达到88.71%，即复合配比为1∶2∶2。本试验开发出3种天然香辛料复合的亚硝酸盐清除剂，为低硝肉制品的开发提供一定的数据参考。但针对香辛调味料功能成分与清除亚硝酸盐的作用机制还需进一步的研究。