PCR技术在动物源性成分检测中的应用

付莎莉 王利刚 张 婧 周正海 陈 欣 费云滟 吴 丹

重庆市食品药品检验检测研究院 重庆 401121

动物源性食品因其含有丰富的人体必需营养物质，成为人们饮食构架中必不可少的组成部分。随着社会发展和消费升级，人们对各种动物源性食品的数量、质量的需求都在增长[1]。实际生产中，不同品种肉类因养殖成本、物流成本等因素影响，其产品销售价格差异较大，一些不法商贩在肉类及其制品中掺杂掺假牟取暴利。肉类掺假不仅影响市场经济秩序，破坏食品营养价值，还存在消费者因食用未标示的肉类原料产生过敏反应的健康问题[2]，以及宗教信仰问题等[3]。肉制品特别是深加工肉制品仅靠感官和肉类形态学为主的鉴别方法，无法准确鉴别其种类和品质，而基于核酸水平的PCR技术可高效、准确检测食品中的动物源性成分，现将PCR及其衍生技术在动物源性成分检测中的应用进展综述如下，以期为食品监管技术手段的选择提供参考。

1 PCR技术原理及其衍生方法

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可以在生物体外将DNA片段准确有效进行复制，实现DNA片段数量大幅度增加。实际工作中，只要能够从样品中提取出微量的DNA，就可以直接利用PCR技术进行扩增，通过对目标DNA片段进行分析比对，便可以获得样品所属物种的信息。随着使用需求的不同，沿用不同的使用条件，PCR技术已经衍生出了多种应用方法，下面就近年来在食品动物源性成分检测中常用的实时荧光PCR法和数字PCR法进行阐述。

1.1 实时荧光PCR法

实时荧光PCR(Real-Time PCR)技术在常规PCR技术基础上，可通过监测PCR扩增过程中荧光染料或特异性标记探针造成的荧光信号的改变，实现对目标DNA的检测[4]。实时荧光PCR法在动物源性成分的检测中的关键在于针对检测目标，选择适宜的荧光标记基团来设计特异性引物。而荧光探针Real-Time PCR技术，还需要设计荧光探针序列。表1列出了猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅的引物和探针序列，在肉类鉴别检测中荧光报告基因往往需要具有较强的特异性，特异性荧光报告基因主要包括线粒体基因DNA、细胞基因组中重复序列和单拷贝序列。Real-Time PCR在动物源性检测中的应用如下。

1.1.1 单重荧光探针法

Zhang[9](2007)等以牛线粒体Cyt b基因为分析对象设计了特异性引物和Taqman荧光探针来检测热处理后的纯肉中牛源性成分及含量，该方法牛DNA最低检出限为35 pg，且未显示与绵羊、山羊或猪的DNA有交叉反应，特异性高。Ali[10](2012)等以猪线粒体Cyt b基因作为分析对象设计了Taqman荧光探针来检测混合肉中是否含有猪源性，该方法检出限低至0.01%，可应用于检测肉制品中是否有猪肉添加。Miguel[11](2005)等以猪线粒体12S rRNA基因作为分析对象设计了猪源性特异性引物，扩增猪肉DNA的411 bp片段，同时扩增几种来自哺乳动物物种DNA的425～428 bp片段用作内源性干扰，结果显示未与其他动物DNA产生交叉反应，该检测方法对猪肉定量检测的灵敏度范围为0.5%～5%。

Yusop[12](2012)等以猪的Cyt b基因作为分析对象设计引物和分子信标探针，建立了Real-Time PCR体系，以多种生肉混合物为样品，检测结果显示出高特异性，其中猪肉的定量检出限为0.001ng，而其他肉类品种均为阴性。Mohanad[13](2018)等以猪的染色体DNA和Cyt b基因为研究对象设计了引物和分子信标探针，用于明胶制品中猪源性成分的定量检测，结果显示基于Cyt b基因的检测方法可检测出体系中10pg的猪DNA，而基于染色体DNA基因的检测方法可检测出体系中1pg的猪DNA。

1.1.2 多重荧光探针法

多重荧光探针法即在Real-Time PCR技术的基础上利用多对引物测定，在动物源性检测中也有较广泛的应用。Iwobi[14](2015)等选择β-肌动蛋白基因和肌肉生长抑制素基因为分析对象，设计引物和Taqman探针，采用三重Real-Time PCR用于定性和定量检测混合肉中牛源性和猪源性成分，结果表明该引物和探针未与其他动物DNA产生交叉反应，定量范围为0.5%～99.5%，检出限为20bp。章晶晶[15](2017)等选择貉子线粒体D-loop基因和狐狸的线粒体基因作为分析对象设计引物和探针，建立了多重荧光PCR体系对肉制品中狐狸、貉子源性成分定量分析，其中最低检测限为狐狸0.5pg/μL、貉子5pg/μL。刘艳艳[16](2016)等选择线粒体基因组16S rRNA基因为分析对象设计引物和分子信标探针建立的多重Real-Time PCR体系能实现对阿胶原料中驴、马、驴骡和马骡源性成分的同时区分，结果显示建立的多重Real-Time PCR体系具有较好的物种特异性和检测灵敏性，最低检测限为0.01ng/μL。Mar[17](2012)等选择t-Glu和Cyt b基因为分析对象设计引物和探针，检测热处理前后混合肉样中猪、牛和鸡肉的含量，最低检出限为原样1%、热处理样0.32pg/μL。Cheng[18](2014)等选择β-肌动蛋白基因和生长因子基因设计引物和Taqman-MGB探针建立多重荧光PCR体系检测鸡、鸭和猪源性成分在混合DNA中的含量，并以鹅、马、兔、牛、驴、鲫鱼、绵羊和山羊8种源性成分作为阴性对照，结构显示该方法具有很强特异性，未产生交叉反应，检测限可达到0.15ng。Druml[19](2015)等选择伪表皮生长因子基因设计Taq man-MGB探针和体系，以鉴别混合肉类DNA中三种鹿的含量，该方法显示出较高特异性，未与肉类产品中可能含有的其他20种动物和43种植物成分产生交叉反应，检测为0.1%。许如苏[20](2017)等选择线粒体基因组为研究对象设计引物及探针，建立了多重Taqman-LNA荧光PCR体系，实现肉制品中猪鸡鸭源性成分的同时检测，且与牛、羊、驴、兔、鹅等常见动物源性成分无交叉反应，特异性高，且其检测限均可低至肉含量的0.001%，灵敏度强。

1.1.3 荧光染料法

荧光染料是能与ds DNA双螺旋小沟区域非特异性结合的染料，在激发光的作用下结合状态染料的荧光强度远远高于游离状态的荧光强度，其荧光信号强度随扩增过程中PCR产物的增加而同步增强，以Sybr Green和EvaGreen较为常见。Soares[21](2013)等以Sybr Green作为荧光染料，选择猪的Cyt b和18S rRNA基因为分析对象设计引物，该方法表现出良好特异性，在猪肉添加量0.1%～25%的混合肉样中检测猪肉的含量，结果表明猪DNA在原样中最低检出量为5pg、热处理样中最低检出量为20ng。郭云霞[22](2012)等选择真核生物18S rRNA为对象设计引物，以SYBR Green I为荧光染料用Real-Time PCR方法检测了多种动植物食品样品中的鲨鱼源性成分，该方法的检出限为0.001ng/μL；Kang[23](2018)等则采用Subr Green染料的Real-Time PCR技术，在100%～0.01%范围内对猪肉和牛肉混合样品中猪肉的含量进行测定，经验证比较得出该方法可以用于检测牛肉加工制品中是否有猪肉掺假。Lubil[24](2018)等选择猪的Cyt b基因为对象设计引物，建立了采用EvaGreen为荧光染料的Real-Time PCR方法来检测肉制品混合物中猪DNA的含量，并且通过9种其他动物和6种蔬菜为阴性对照，证明了该方法对猪DNA具有特异性。该法在检测生猪肉和鸡肉混合物时检出限可低至0.001%。同样以Cytb基因为对象进行新引物设计，Meira[25](2017)等建立了定性定量检测体系检测加工食品中马肉掺假，该方法表现出高灵敏度和特异性，在牛和马的混合样品的检测中，最低可检测到的马DNA为0.1pg。Joana[26](2017)等采用EvaGreen荧光染料建立定量检测体系，通过熔解曲线于标准曲线的比对对肉制品中猪肉含量进行定量检测，并利用未知肉混合物进行重复验证，得出该方法特异性较强、重复性高，猪DNA的最低检出限为0.01pg。Sakalar[27](2015)等选择猪和马的12S rRNA和16S rRNA基因为对象设计引物，EvaGreen为荧光染料建立了多重Real-Time PCR技术，可实现在0.1%～10%范围内对混合肉中马和猪肉的含量进行同时检测，检出限低至0.00001ng/μL。Sakalar[28](2016)等还设计了基于EvaGreen的双重Real-Time PCR检测体系来检测肉制品中猪肉和牛肉掺假，该体系异性强，灵敏度可达0.001%。

1.2 数字PCR法

单一的Real-Time PCR技术虽能实现相对定量，但需要建立已知拷贝数的标准曲线才能比对出目标序列的拷贝数，而检测结果受扩增效率的影响较大，所以该方法不能对目标序列精确定量，而数字PCR技术的出现实现了核酸的绝对定量。数字PCR的快速发展得益于微流控技术的逐渐成熟，先后发展出基于微反应腔室、集成化微流控芯片和微滴技术的数字PCR系统[29]，微流控芯片式数字PCR(cdPCR)技术通过将纳升级的液体样品封闭在由多个独立的微池或微通道组成的集成芯片后，进行PCR扩增，并根据不同微池或微通道的荧光信号情况判读。微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一种利用水油乳化液滴系统进行数字PCR的方法[30～33]。两者中微滴数字PCR具有一定优势，以下重点介绍微滴数字PCR的应用。

Cai[34](2014)等通过应用微滴数字PCR技术，对猪肉和鸡肉产品进行定量分析，研究结果表明，肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数量之间均呈线性关系。在此基础上，建立了根据DNA拷贝数计算肉质量的模型。并通过人工比例污染试验，混合已知比例的猪肉和鸡肉，以验证该方法的准确度和适用性，获得了较好的验证结果。该团队于2017年通过应用双微滴数字PCR技术，对肉制品中牛肉源性和猪肉源性成分进行检测，并进一步定量。该方法实现了在一个数字PCR反应管内同时对牛肉和猪肉混合样品中的源性成分进行识别和定量，同时，通过已知比例成分的混合肉类样品验证了该方法的准确性和适用性[35]。该团队于2018年通过应用微滴数字PCR技术，对肉制品中山羊肉和绵羊肉含量的检测和定量进行了研究，建立了一套基于DNA拷贝数的肉质量计算模型。并使用不同动物品种(24种)的样本进行了专一性的验证，其中包括山羊和绵羊每个种属各5个品种。方法采用含有山羊和绵羊特异基因片段的质粒作为正对照用于校正，方法结果显示山羊和绵羊的检出限和定量限分别为1 copies/μL和5 copies/μL。采用将山羊和绵羊肉按比例混合的模拟样品进行了准确性和适用性的验证。结果显示该方法具有很高的精确度，具有较好的应用前景[36]。

Floren[37](2015)等以真核生物核F2基因作为目标靶点，开发了一种两步式微滴数字PCR方法，用于检测肉制品加工过程中牛、马、猪源性成分的含量并与荧光定量PCR法进行比较，结果表明微滴数字PCR法更具有优势，定量限低至0.01%，检出限为0.001%。并采用了14种物种验证其特异性，未显示出交叉反应。Ren[38](2017)等通过采用微滴数字PCR方法对绵羊、山羊为原料的肉制品中的鸡肉含量进行定量检测，该方法在检验计算过程中引入倍数因子，将扩增拷贝数的比例换算为肉源性含量的比例，该法对经过热处理和超高压处理后的样品同样具有较好的重复性和稳定性，且原料动物不同部位采样对该方法的精确度无影响。

Noh[39](2019)等建立了一种用于定量分析海产品中阿拉斯加鳕鱼含量的微滴式数字PCR方法，确立了鱼肉质量、DNA含量和DNA拷贝数量之间的线性关系，在此基础上建立了以DNA拷贝数为计算基础的肉质量计算模型。通过对已知比例混合样品进行定量分析验证了其准确性和适用范围。结果显示，该方法可用于海产品中阿拉斯加鳕鱼的检测及定量分析，可应用于产品质量及真实性认证。史艳宇[40](2018)等以鸭线粒体基因为目标靶点设计引物和探针，通过微滴数字PCR进行扩增检测和分析，建立了产品中鸭源性成分的检测和定量分析方法，与荧光定量PCR比较后得出该方法灵敏度高于荧光定量PCR。

2 研究展望

目前对肉类源性的鉴别检测主要集中在对蛋白质的检测和对核酸的检测两方面。但是蛋白质检测的开展需要高要求的仪器和样品前处理方法，前处理复杂、试剂成本高、耗时长、特异性较差，且往往不适用于经热加工处理的肉制品，仅适用于对新鲜肉类的检测。而基于核酸的检测方法更具优势，通过对数据库内已知种类特异DNA序列的比对判定样品种类，更适用于检测未知样品。

Taqman荧光探针在实际实验中存在一定的局限性，无法应对靶基因特异序列较短的情况。对体系中存在的与靶基因同源的序列，也很容易出现非特异性扩增，造成最终定量不准确。分子信标灵敏度强，可检测出单个核苷酸的突变，可以应对靶基因特异序列较短状况，但其设计要求复杂，且成本较高[24]。荧光染料法可用于dsDNA序列的扩增监测，相对荧光探针法设计要求简单，成本低。基于Real-Time PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作便捷的特点，近年来广泛应用于快速定量检测，在食品检测领域更是具有较高的应用价值。利用Real-Time PCR技术为基础，大量研究建立了畜禽产品、水产制品、奶制品的检测方法，可应用于肉类掺假、奶制品掺假的鉴别。采用Real-Time PCR技术时仍需注意：荧光染料法虽然检测简便、价格便宜，但染料与DNA双链的结合为非特异性结合，往往会出现多个终产物，则需要通过扩增曲线的判断来确定多个终产物的特异性[38]。荧光探针法比荧光染料法具有更强的特异性，但至关重要的目标基因选择以及引物探针设计还较为困难，若体系中存在与靶基因同源的序列，则易出现非特异性扩增，使得定量不准确。数字PCR法是近几年才新出现的技术，可以检测出混合复杂样品中的微量核酸，灵敏度极高，且可以实现核酸的绝对定量。因其具有的明显优势已在成分鉴定检测领域快速发展，在动物源性食品成分检测中也具有重要作用。

数字PCR技术的应用，使很多动物源性食品掺假制假的研究，从以往片面的定性检测实现了精准定量检测的跨越，检测数据能反应混合样品中不同动物源性材料的含量，进一步掌握动物源性制品掺假程度。现阶段微生物检测领域和植物转基因检测领域已经制定了相关方法和标准，但在动物源性成分检测方面检测方法标准仍空缺，所需试剂和ddPCR仪器价格居高不下，造成了ddPCR在常规实验室普及率低。未来随着国家监管投入增加和设备价格的降低，微滴数字PCR将更加普及，成为动物源性食品监管的检测技术支撑。