响应面法优化复合酶酶解制备可口革囊星虫胶原蛋白抗氧化肽工艺研究

彭易鑫，陆旭丽 ，代亚萍，曹玉坡，李积华，龚 霄，庞 杰

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.中国热带农业科学院农产品加工研究所，农业农村部热带作物产品加工重点实验室，广东湛江 524001；3.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东湛江 524001）

可口革囊星虫（Phascolosoma esculenta）属星虫动物门，革囊星虫纲，革囊星虫目，革囊星虫科，俗称海泥丁、土笋等，是栖息于浅海沙、泥沙底质等环境中的一种海洋环节动物，广泛分布于我国福建、广东、广西等地[1]。可口革囊星虫具有广泛的药用价值，有滋阴、补肾、去火的食疗作用，被誉为“动物人参”、“海中的冬虫夏草”[2]。可口革囊星虫富含蛋白质、不饱和脂肪酸、多糖、微量元素等多种营养物质，为典型高蛋白低脂肪海产品[3]。胶原蛋白（collagen）又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质,常以纤维形式存在于动物体组织中，是动物体内含量最多的一类蛋白质[4]。胶原蛋白酶解后，得到分子量在2000 Da以下的多肽，容易被人体吸收，没有过敏反应，还可促进食品中其它蛋白质的吸收，是一种具有较强抗氧化活性的多肽[5]。研究表明，低分子活性胶原蛋白及多肽具有促进伤口愈合[6]、抗菌[7]、抗氧化[8]、降血压[9]、免疫调节[10]等多种活性。目前，胶原肽已成为继胶原蛋白后生物医药、食品等的热门原料之一。

国内外近几年在开发水产胶原蛋白抗氧化活性肽方面做了大量的研究。秦倩倩等[11]从草鱼皮中提取胶原蛋白并通过酶解法制备得到具有抗氧化功效的多肽；李露园等[12]通过酶法制备鲟鱼皮胶原蛋白多肽并发现其具有良好的抗氧化作用；Wu等[13]以鲑鱼皮为原料酶解制备胶原蛋白肽，研究表明该多肽具有良好的抗氧化功效。然而，目前水产胶原蛋白抗氧化肽的制备多以鱼皮、鱼肉等为原料，这大大限制了水产胶原蛋白抗氧化肽的生产与开发。此外，水产胶原蛋白抗氧化肽的制备方法多采用单酶酶解。研究表明，蛋白的酶解程度与抗氧化活性肽段生成的数量直接相关，且酶解过程中酶种类的选择以及酶解工艺参数对多肽抗氧化活性的高、低起着决定性作用[14]。另外，采用两种或以上蛋白酶复合酶解可以得到比单酶酶解更好的酶解效果，如碱性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶等的复配使用不仅能增加蛋白质利用率，且能在一定程度上提高水解度[15]。

因此，本研究以可口革囊星虫为原料，从中提取胶原蛋白，然后以总抗氧化能力和超氧阴离子清除率为考察指标，通过蛋白酶的筛选及复合酶组合试验确定最佳酶解方案，在单因素实验基础上运用响应面法优化复合酶酶解制备可口革囊星虫胶原蛋白抗氧化肽的酶解工艺，得到抗氧化活性较强的胶原蛋白肽，以期为可口革囊星虫胶原蛋白抗氧化肽的进一步研究和开发利用提供理论依据。课题的研究可以为胶原蛋白抗氧化肽的来源提供新的途径，对可口革囊星虫的开发利用具有重要价值，对水产及水产品加工业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

可口革囊星虫 湛江农贸市场；酸性蛋白酶（50000 U/g）、中性蛋白酶（60000 U/g）、碱性蛋白酶（200000 U/g）、胃蛋白酶（250000 U/g）、胰蛋白酶（250000 U/g）、木瓜蛋白酶（800000 U/g）、羟脯氨酸含量检测试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒、超氧阴离子清除能力检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；透析袋 湛江科铭科技有限公司；其它试剂 均为国产分析纯。

U-T6系列紫外可见分光光度计 屹谱仪器制造（上海）有限公司；台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海力辰邦西仪器科技有限公司；pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；低温离心机 德国Sigma公司；真空冷冻干燥机 上海力辰仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 可口革囊星虫胶原蛋白肽的制备工艺流程可口革囊星虫→预处理→绞碎匀浆→酸溶→盐析→超声、振荡→离心→透析→冷冻干燥→酶解→灭酶→冷却→冻干→胶原蛋白肽[16]。

操作要点：称取1 kg可口革囊星虫成虫，清除内脏，清洗并剪碎后，加入10%的正丁醇溶液萃取一天，除去脂肪，再加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡48 h，除去杂蛋白，用纱布过滤，蒸馏水清洗至中性，搅碎匀浆，匀浆转速1500 r/min，5～10次，每次10～20 s，浆液倒入0.5 mol/L冰醋酸中超声20 min，然后于摇床中振荡20 min，于4 ℃冰箱放置48 h后，用纱布过滤，向滤液中加入3 mol/L NaCl溶液盐析，待胶原以白色絮状沉淀析出后，4 ℃，10000 r/min离心20 min，取沉淀，弃去上清液，将沉淀复溶于0.5 mol/L冰醋酸，再次4 ℃，10000 r/min离心20 min，弃去沉淀，取上清液进行透析，先用0.1 mol/L冰醋酸透析2 d，每4 h换一次透析液，再用蒸馏水透析，每4 h换一次蒸馏水，直至滤液中无氯离子（硝酸银检验无白色沉淀）且透析液为中性时，停止透析，冻干，得到可口革囊星虫胶原蛋白，于-20 ℃冰箱储藏备用。称取可口革囊星虫胶原蛋白5 g，加入150 mL磷酸盐缓冲液（pH7.5，0.02 mol/L），调节恒温加热磁力搅拌器至所需温度，用HCl或NaOH调节缓冲液pH至所需酶解pH，加酶进行酶解，酶解达到预定时间后，于沸水中煮沸5 min灭酶，终止反应，快速冷却至室温，用离心机于4 ℃以10000 r/min离心15 min，收集上清，冻干即得到胶原蛋白肽。

1.2.2 蛋白酶的筛选 分别以胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶为水解用酶，于最适反应条件下酶解可口革囊星虫胶原蛋白（见表1），以总抗氧化能力和超氧阴离子清除率为考察指标，选择四种优势蛋白酶进行后续实验。

老张，你是葫芦套人。老冬瓜说，老鳜鱼要杀人，你说说他要杀谁？在你们村，以前，村长睡过他老婆，这事儿他是咋解决的？是像传说的那样，村长请他吃了一顿饭，事儿就全部了结啦。你说说细节吧，大伙儿想听哩。

表1 不同蛋白酶酶解试验条件Table 1 Experimental conditions of enzymatic hydrolysis with different proteases

1.2.3 酶解方案设计 选择酶解效果较好的四种蛋白酶，分别进行单酶酶解和复合酶解，酶解方案及酶解条件见表2，以酶解产物的总抗氧化能力和超氧阴离子清除率为指标，确定最佳酶解方案[17-18]。

表2 不同酶解方案的试验条件Table 2 Test conditions for different enzymatic hydrolysis schemes

1.2.4 酶解单因素实验 固定料液比1:30 g/mL，复合酶添加量6000 U/g，复合酶比例1:1（酶活力），酶解温度50 ℃，酶解pH6.5，酶解时间4 h，以料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）、复合酶添加量（2000、4000、6000、8000、10000 U/g）、复合酶比例（1:2、1:1.5、1:1、1.5:1、2:1）、酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）为因素，改变其中一个因素，保持其他因素不变，考察这些因素对可口革囊星虫胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响[19-20]。

1.2.5 响应面试验设计 根据单因素实验结果，选择复合酶添加量、酶解温度、酶解pH、酶解时间为影响因素，以总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的总评归一值（OD）为响应值，进行四因素三水平的响应面分析试验[21-22]。试验因素及水平见表3。

表3 响应面试验因素水平表Table 3 Response surface test factor level table

1.2.6 抗氧化活性测定

1.2.6.1 总抗氧化能力测定 将试剂盒中的试剂一、试剂二、试剂三按7:1:1的比例混合，预温到37 ℃，吸取900 μL混合液于1.5 mL离心管中，蛋白水解液经灭酶离心后，吸取30 μL样品液于离心管中，加入90 μL双蒸水，同时设置空白对照，充分混匀，反应10 min，测定593 nm下的吸光值，带入标准曲线方程求得Fe2+终浓度x（μmol/mL），结果按下式计算：

式中：x表示Fe2+终浓度，μmol/mL；V反总表示反应总体积，1.02 mL；V样表示反应样本体积，0.03 mL。

1.2.6.2 超氧阴离子清除率测定 取3个1.5 mL的离心管，分别作为空白管、对照管和测定管，同时加入40 μL试剂一，空白管加入200 μL蒸馏水，对照管加入160 μL试剂二和100 μL蒸馏水，测定管加入160 μL试剂二，充分混匀，25 ℃反应1 min，然后空白管和对照管加入200 μL试剂三，测定管加入100 μL样品溶液和200 μL试剂三，充分混匀，37 ℃反应30 min，向空白管、对照管和测定管同时加入200 μL试剂四和200 μL试剂五，充分混匀，37 ℃显色20 min，空白管调零，在530 nm处测定对照管和测定管的吸光值，结果按下式计算：

式中：A对照表示对照管吸光值；A测定表示测定管吸光值。

式中：d表示单指标评价值；d1表示总抗氧化能力指标评价值；d2表示超氧阴离子清除率指标评价值；Yi表示指标中第i个值；Ymin表示指标中最小值；Ymax表示指标中最大值。

1.3 数据处理

所有试验均进行3次平行实验，数据采用平均值±标准差的形式，采用Design-Expert V8.0软件、Excel 2016和OriginPro 9.1软件分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶筛选试验结果

如图1，木瓜蛋白酶的酶解产物总抗氧化能力和超氧阴离子清除率效果最好，中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶其次，胰蛋白酶和碱性蛋白酶较差，这可能是由于木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶能有效作用于胶原蛋白表面结构，准确地进行酶解反应，因而水解作用较强，而胰蛋白酶和碱性蛋白酶相对较弱[25]。因此本试验选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和酸性蛋白酶确定复合酶解方案。

图1 不同蛋白酶酶解试验结果Fig.1 Experimental results of enzymatic hydrolysis with different proteases

2.2 酶解方案试验结果

如图2，双酶复合酶解（方案G5、G6、G7、G8、G9、G10）得到的多肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均明显高于单酶酶解（方案G1、G2、G3、G4），且木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解（方案G5）得到的多肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均最高，分别为（1.253±0.013）μmol/mL和70.47%±1.05%。由于蛋白酶具有专一性，单酶只能水解几个固定的氨基酸残基，水解程度受到限制，复合酶切断肽键的位置不同，能进一步降低产物的分子量，得到分子量合理分布的水解液[26]。因此，本试验选择木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解方案，制备可口革囊星虫胶原蛋白抗氧化肽。

图2 不同酶解方案的试验结果Fig.2 Results of different enzymatic hydrolysis schemes

2.3 单因素实验

2.3.1 液料比对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图3，增加提取液用量，胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子均呈先增大后减小的趋势，在料液比1:30 g/mL时，总抗氧化能力达到最大值（1.272±0.027）μmol/mL，超氧阴离子清除率达到最高70.08%±1.09%。这可能是由于提取液用量较低时，物料的粘稠度影响底物与酶的接触，酶解效率较低，随着提取液用量的增多，酶与底物更多的接触，酶解反应加快，但当提取液用量太多时，底物浓度过低导致酶解效率降低[27]。综合胶原肽测定结果，确定料液比为1:30 g/mL。

图3 料液比对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.2 复合酶添加量对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图4，增加复合酶添加量，胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均呈先增大后缓慢减小的趋势，当复合酶添加量为8000 U/g时，总抗氧化能力达到最大值（1.276±0.019）μmol/mL，超氧阴离子清除率达到最高67.80%±0.76%。酶促反应一般随酶量的增加而增强，当酶量增加至饱和状态时，酶解效果会趋于稳定，但复合酶之间因可能存在相互影响而抑制酶活力，进而影响游离氨基态氮的生成[28]。综合胶原肽测定结果，确定复合酶添加量为8000 U/g。

图4 复合酶添加量对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.4 Effects of compound enzyme addition amount on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.3 复合酶比例对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图5，随着木瓜蛋白酶比例增加，胶原肽总抗氧化能力呈先增大后减小的趋势，超氧阴离子清除率呈先减小后增大再减小的趋势，当复合酶比例为1:1时，总抗氧化能力最大为（1.283±0.014）μmol/mL，复合酶比例为1.5:1时，超氧阴离子清除率达到最高67.53%±0.59%。这可能是由于酶解过程中两种酶分子均达到酶解反应的稳态，某一种酶占比过高则会打破这种稳态的体系[29]。综合胶原肽测定结果，确定复合酶比例为1:1。

图5 复合酶比例对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.5 Effects of complex enzyme ratio on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.4 酶解温度对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图6，升高酶解温度，胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均呈先增大后减小的趋势，当酶解温度为50 ℃时，总抗氧化能力达到最大值（1.245±0.007）μmol/mL，酶解温度为55 ℃时，超氧阴离子清除率达到最高67.61%±0.94%。这是由于在一定温度范围内，温度升高会增强酶活性，但过高温度会让酶活性降低甚至失活，导致酶解作用减弱[30]。综合胶原肽测定结果，确定酶解温度为50 ℃。

图6 酶解温度对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.5 酶解pH对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图7，随着pH的增大，胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均呈先增大后减小的趋势，当pH为6.0时，超氧阴离子清除率达到最高69.06%±0.51%，当pH为6.5时，总抗氧化能力达到最大值（1.249±0.015）μmol/mL。说明只有在最适的pH范围内，酶与底物才会充分结合，pH偏高或偏低都会抑制酶活性,甚至使酶失活[31]。综合胶原肽测定结果，确定酶解pH为6.5。

图7 酶解pH对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.7 Effects of enzyme solution pH on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.3.6 酶解时间对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响 如图8，延长酶解时间，胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率均呈先增大后减小的趋势，酶解时间为3 h时，超氧阴离子清除率达到最高68.98%±1.18%，酶解时间为4 h时，总抗氧化能力达到最大值（1.281±0.008）μmol/mL。这是因为在一定时间范围内延长酶解时间，酶解反应逐渐彻底，超出此范围后反而会抑制酶活性的发挥[32]。综合胶原肽测定结果，确定酶解时间为4 h。

图8 酶解时间对胶原肽总抗氧化能力和超氧阴离子清除率的影响Fig.8 Effects of enzymatic hydrolysis time on total antioxidant capacity and superoxide anion clearance rate of collagen peptide

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面试验设计及结果 试验设计及结果见表4，通过响应面对总评归一值（OD）与复合酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解pH（C）、酶解时间（D）进行数学关系表达，得到拟合回归方程模型：OD=0.95+0.17A+0.076B-0.050C+0.084D-3.500×10-3AB+1.250×10-3AC+0.051AD-0.026BC+2.500×10-4BD-2.500×10-4CD-0.20A2-0.24B2-0.24C2-0.20D2。

表4 响应面试验设计及结果Table 4 Design and results of response surface test

回归方程模型的显著性检验和方差分析结果见表5，该模型F值为56.34，P值小于0.0001，为差异极显著，说明方程模型拟合极显著，失拟项P值为0.0658（P＞0.05），为差异不显著，则回归方程模型有显著意义[33]。模型可信度和准确性的检验指标为决定系数（R2）和调整决定系数（R2Adj），两个数值相差越小且越接近1，则证明模型试验数据越有效[34]。本试验中，决定系数R2为0.9049，调整决定系数R2Adj为0.9651，说明回归方程模型适合胶原肽制备工艺的分析与预测。该回归方程的一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2、D2极显著（P＜0.01），二次项AD差异显著（P＜0.05）。对比各因素的F值大小可知，对可口革囊星虫胶原肽抗氧化活性的影响顺序为：复合酶添加量（A）＞酶解时间（D）＞酶解温度（B）＞酶解pH（C）。

表5 回归方程模型的显著性检验及方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

图9 ～图14，随着各因素水平的升高，抗氧化活性均呈现先增大后减小的趋势。图9～图14显示，沿A因素轴方向的响应面坡度明显比较陡峭，说明复合酶添加量相对酶解温度、酶解pH、酶解时间影响较大；图12显示，沿B因素轴方向的响应面坡度较陡峭，说明酶解温度对胶原肽抗氧化活性的影响较酶解pH大；图13～图14显示，沿D因素轴方向的响应面坡度较陡峭，说明酶解时间相对酶解温度、酶解pH影响较大。响应面水平方向的投影为等高线，交互作用显著时，等高线为椭圆，交互作用不显著时，等高线为圆形[35]。上述6组等高线图显示，复合酶添加量与酶解时间的等高线图为椭圆形，交互作用最强；其次是酶解温度与酶解pH；复合酶添加量与酶解温度、复合酶添加量与酶解pH、酶解温度与酶解时间、酶解pH与酶解时间的等高线图为圆形，交互作用较弱。

图9 复合酶添加量与酶解温度交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.9 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis temperature on antioxidant activity of collagen peptide

图12 酶解温度与酶解pH交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.12 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on antioxidant activity of collagen peptide

图13 酶解温度与酶解时间交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.13 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

图14 酶解pH与酶解时间交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.14 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of enzymatic hydrolysis pH and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

图10 复合酶添加量与酶解pH交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.10 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis pH on antioxidant activity of collagen peptide

图11 复合酶添加量与酶解时间交互作用对胶原肽抗氧化活性影响的响应面和等高线图Fig.11 Response surface and contour plot of the effect of the interaction of compound enzyme addition amount and enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity of collagen peptide

2.4.2 确定最佳酶解工艺参数 通过响应面回归方程模拟优化，得到最佳酶解条件：复合酶添加量8135.25 U/g、酶解温度51.58 ℃、酶解pH6.39、酶解时间4.17 h，预测OD值为0.989。参考实际操作，修正酶解条件为复合酶添加量8135 U/g、酶解温度51.6 ℃、酶解pH6.4、酶解时间4.2 h，在此条件下进行3组验证试验，测得胶原肽的总抗氧化能力为（1.333±0.021）μmol/mL，超氧阴离子清除率为78.75%±0.94%，OD值为0.986，与响应面回归模型所得到的预测值（0.989）非常接近，说明这次响应面分析的回归模型可以很好地预测实际试验结果[36]，说明通过响

应面优化得到的复合酶酶解制备可口革囊星虫胶原蛋白抗氧化肽的工艺条件确实可行，具有实际应用价值。

3 结论

通过单因素实验和响应面试验设计法得到复合酶酶解制备可口革囊星虫胶原抗氧化肽的最优工艺条件为复合酶添加量8135 U/g、酶解温度51.6 ℃、酶解pH6.4、酶解时间4.2 h，该条件下测得胶原肽的总抗氧化能力为（1.333±0.021） μmol/mL，超氧阴离子清除率为78.75%±0.94%，OD值为0.986，相比优化前的胶原肽抗氧化活性（总抗氧化能力为（1.253±0.013） μmol/mL，超氧阴离子清除率为70.47%±1.05%）有明显的增强效果，因此，通过响应面优化后的酶解工艺条件，能够制备抗氧化活性更强的胶原蛋白肽。