添加糖与酱油对油炸鲟鱼晚期糖化终末产物形成的影响研究

刘芹邑，张 琪，安 婧，董士远

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266000）

食品加工中发生美拉德反应所形成的潜在危害安全物质如丙烯酰胺（acrylamide，AA）、杂环胺（heterocyclic amines，HAs）和晚期糖化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）等[1]已受到广泛关注。AGEs是经过美拉德反应中期、后期阶段形成的一类复杂化合物的总称。近年来，羧甲基赖氨酸（N-ε-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基赖氨酸（N-ε-carboxyethyllysine，CEL）作为食品AGEs标志性产物备受关注，而甲基乙二醛氢咪唑酮（N-δ-(5-hydro-5-methyl-4-imidazolon-2-yl)-ornithine，MGH1）目前关注较少。美拉德反应中期阶段产生高活性醛类及二羰基化合物，包括乙二醛（Glyoxal, GO）、甲基乙二醛（Methylglyoxal, MGO）与赖氨酸侧链共价结合形成 CML、CEL，MGO与精氨酸侧链共价结合形成MG-H1[2]。目前大量证据表明，膳食AGEs易在体内积累，与诸如动脉粥样硬化、肾脏疾病等慢性疾病的发生相关[3-4]。

影响食品AGEs形成的因素主要包括食品成分、加工方式和加工辅料。食品中含有较高的蛋白、脂质和糖类，高蛋白高脂肪食品AGEs相对含量高，低脂牛奶制品、蔬菜、水果等AGEs含量较少[5]。此外，一般来说，干热加工对食品AGEs形成的促进作用强于湿热（蒸煮）加工[6-7]。蔗糖在受热条件下可分解为葡萄糖和果糖衍生物，继续受热则会产生羰基化合物[8]，这些都是美拉德反应前体物质，为促进AGEs的形成提供可能。Li等[9]通过使用微波加热蔗糖-赖氨酸模式体系，证明美拉德反应的产生且形成CML；Cerny等[10]发现蔗糖的添加有助于蛋氨酸-葡萄糖模式体系中葡萄糖降解以及Amadori产物形成；Liang等[11]发现蔗糖-赖氨酸模式体系初始摩尔比的增加可以显著促进吡咯素的形成。酱油本身含有一定量的AGEs前体物质，Liu等[12]发现深色酱油MGO含量明显高于蚝油，但GO含量低于醋和蚝油。酱油所含氨基肽氮较多[13]，添加到食品中可能促进AGEs形成。Chao等[14]发现在肉类中添加酱油进行烹饪后，CML和戊糖素显著升高。

迄今为止，关于糖和酱油添加水平对食品AGEs形成影响的报道较少。鲟鱼是我国主要淡水养殖鱼类，其肉中蛋白质含量高，富含必需氨基酸和多不饱和脂肪酸，相关鲟鱼产品的开发受到越来越多的重视。本研究采用鲟鱼为材料，通过添加不同比例的绵白糖和酱油并进行油炸处理，首次系统探究绵白糖和酱油对油炸鲟鱼AGEs及其前体物质糠氨酸、二羰基化合物形成的影响，为油炸水产品AGEs形成和控制提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西伯利亚鲟、史氏鲟的杂交鲟鱼（Acipenser baerii×Acipenser schrenckii） 青岛市城阳区鲟鱼养殖场，每条平均体重约1.5～2.5 kg，活鲟鱼运送至实验室，去除鱼头、鱼皮和鱼骨，将鱼肉搅碎备用；AGEs标准品：羧甲基赖氨酸（CML）、羧乙基赖氨酸（CEL）、甲基乙二醛氢咪唑酮（MG-H1）、D4-羧甲基赖氨酸（D4-CML）、D4-羧乙基赖氨酸（D4-CML）、D3-甲基乙二醛氢咪唑酮（D3-MG-H1） 纯度均大于99%，加拿大TRC公司；甲醇（色谱纯） 德国Merck公司；糠氨酸（Furosine）标准品 Neosystem Laboratoire公司；其他试剂 均为分析纯或色谱纯。

1290/6460液相色谱/质谱联用仪 美国Agilent公司；T18basic高速均质分散机 德国IKA公司；GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；LC-20AT 高效液相色谱仪、UV-2550紫外可见分光光度计、F-4600荧光分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲟鱼饼制备 将绞碎的鲟鱼肉与1%食盐混合均匀，按照表1加入调味料并搅拌均匀。调味料比例是根据预实验添加调味料后鲟鱼饼的滋味来确定的。随后使用模具制作重量约40 g、直径6.5 cm、厚度1 cm的鲟鱼饼，设置对照组为不添加绵白糖和酱油的鲟鱼饼。预实验结果表明，在170 ℃油温下油炸9 min的鲟鱼饼品质佳，故将鲟鱼饼浸没在170 ℃的大豆油油炸9 min，每隔90 s翻转一次。油炸后的鲟鱼饼经冷却、称重、搅碎、混匀后储存在-20 ℃以作进一步分析。所以样品均在3 h内制备完毕。

表1 调味料添加比例（w/w，%）Table 1 Seasoning addition ratio(w/w, %)

1.2.2 糠氨酸含量测定 参照Tavares等[7]采用高效液相色谱法检测油炸鲟鱼饼糠氨酸含量变化。准确称取200 mg样品于安瓿瓶中，加入2 mL 9 mol/L HCl并密封，在110 ℃酸解24 h。酸解液经0.22 μm滤膜过滤。取Sep-Park C18柱活化、平衡，取0.5 mL滤液经由此柱净化，并用3 mL 3 mol/L HCl洗脱，收集洗脱液。使用 Allitima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行分离分析。流动相A为0.4%乙酸水溶液，流动相B为含有0.3%氯化钾的0.4%乙酸水溶液。采用等度洗脱，流动相A比例为98%，流动相B比例为2%，流速设定为1 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃。

1.2.3 甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）含量测定参照Zhu等[15]进行二羰基化合物含量的测定。

1.2.3.1 样品前处理 称取1 g样品添加10 mL水震荡提取3 h，然后添加10 mL甲醇沉淀蛋白，并于5000 ×g离心20 min。取2 mL上清液，加入100 μL 40 mg/mL邻苯二胺于60 ℃衍生2 h；添加2 mL 50%甲醇的水溶液，过0.22 μm滤膜于进样小瓶。标准品浓度设为0～0.25 μg/mL。

1.2.3.2 样品的检测 采用LC-MS/MS分析方法对样品中MGO、GO含量进行检测。采用Symmetry C18（2.1×100 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相A为0.1%甲酸甲醇，流动相B为0.1%甲酸水。流速为0.3 mL/min，流动相梯度设定如下：0～10 min，70%～40% B；10～12 min，40%～70% B；12～15 min，70% B。柱温设定为30 ℃。质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，多重反应监测模式（MRM），监测参数见表2。

表2 二羰基化合物多重反应监测参数Table 2 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.2.4 荧光AGEs含量测定 参照 Delgado-Andrade等[16]的方法检测油炸鲟鱼饼荧光性AGEs含量变化。称取4 g 样品分散于20 mL 0.2 mol/L pH8.2 的磷酸盐缓冲液中，然后加入40 μL碱性蛋白酶，并在55 ℃条件下恒温水浴1 h。冷却至室温后，在8000×g条件下离心15 min，随后取上清检测荧光值，激发波长设定为347 nm，发射波长设定为415 nm，狭缝宽度设定为5 nm。以1 μg/mL的硫酸奎宁作为100%荧光强度，样品荧光强度以AU/100 mg protein表示。

1.2.5 CML、CEL、MG-H1含量测定 参照Sun等[17]的方法检测油炸鲟鱼饼CML和CEL含量变化。

1.2.5.1 样品预处理 取40 mg样品于安瓿瓶中，加入0.4 mL、0.2 mol/L、pH9.2的硼酸盐缓冲液和0.08 mL的2 mol/L硼氢化钠溶液（以0.1 mol/L的NaOH配制），并在4 ℃条件下放置8 h，然后添加0.8 mL、6 mol/L HCl，并密封，在110 ℃条件下酸解24 h，并在60 ℃条件下干燥，随后以2 mL超纯水复溶。取Sep-Park MCX柱活化、平衡，取复溶液经由此柱净化，并用3 mL含有5%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液，使用0.22 μm滤膜过滤，待上机检测。用浓度均为5 μg/mL的CML-d4、CEL-d4、MG-H1-d3、CML、CEL、MG-H1配制2 mL含0.05 μg/mL内标品的标准品溶液。

1.2.5.2 样品检测 采用液相色谱-质谱联用法（LCMS/MS）对所制得的样品进行检测，使用HILIC Silica column（2.1×100 mm，3 μm）色谱柱对待测物进行分离分析。流动相A为0.1%甲酸甲醇，流动相B为0.1%甲酸水。流速为0.2 mL/min，流动相梯度设定如下：0～3 min，20%～50% B；3～6 min，50%B；6～6.1 min，50%～20% B；6.1～12 min，20% B。柱温设定为35 ℃。质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，多重反应监测采集模式（MRM），采集参数见表3。

表3 AGEs 多重反应监测采集参数Table 3 Mass spectrometric parameters for multiple reactions monitoring AGEs

1.3 数据处理

本实验设计的所有指标均设计3个平行，实验结果以平均值±标准偏差表示，所有数据统计分析利用R（v3.5.0）及R Studio（v1.1.453）软件进行，P＜0.05为有显著差异。所有实验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 添加绵白糖与酱油对油炸鲟鱼饼糠氨酸含量的影响

糠氨酸是美拉德反应前期的前体物质Amadori产物经过酸化水解而产生[18]，被认为是评价食品加工热处理强度的技术指标[19]。酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼糠氨酸含量影响如图1所示。油炸鲟鱼饼糠氨酸含量随绵白糖、酱油添加水平增加而增加。与Con相比，T1、T2、T3组糠氨酸含量由15.90 μg/100 mg protein显著升高到26.49 μg/100 mg protein及以上（P＜0.05），这表明绵白糖的添加大大提高油炸鲟鱼饼糠氨酸含量。蔗糖虽是非还原性糖，不能参与美拉德反应，但其加热后的分解产物之一为葡萄糖[20]，为美拉德反应提供充足的反应物。本团队的另一研究发现，与未添加糖粉的虾饼相比，单独添加3%糖粉的烘焙虾饼和微波虾饼糠氨酸含量分别增加33.3%和28.9%[21]。酱油中含有少量葡萄糖，因此添加酱油也会导致糠氨酸含量的增加。绵白糖与酱油同时添加则进一步导致糠氨酸含量增加，最高可达55.88 μg/100 mg protein。方差分析显示，绵白糖和酱油对糠氨酸含量均具有极显著性影响（P＜0.01），绵白糖与酱油共同添加则产生显著协同作用影响（P＜0.05），共同促进糠氨酸产生。

图1 酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼中糠氨酸含量的影响Fig.1 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on furosine content in fried sturgeon patties

2.2 添加绵白糖与酱油对油炸鲟鱼饼MGO、GO含量的影响

酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼中MGO、GO含量影响如图2所示。T1、T2、T3组MGO、GO含量逐渐增加，表明仅添加绵白糖可促进油炸鲟鱼饼中MGO、GO的产生，且随着添加量的增加逐渐增加。有研究表明蔗糖在加热过程中会发生焦糖化反应，并能够将降解产生二羰基化合物[22-23]。与对照相比，J1组MGO、GO含量显著升高（P＜0.05），而J2组GO含量显著降低（P＜0.05），表明1%酱油的添加促使油炸鲟鱼饼中 MGO、GO形成；2%酱油的添加抑制GO形成。绵白糖与酱油共同添加时，MGO、GO含量呈现非线性变化。在绵白糖固定添加水平情况下，MGO、GO含量随酱油添加水平增加而逐渐减少。方差分析显示，绵白糖与酱油共同添加时产生交互作用影响（P＜0.05）。当绵白糖添加量为3%、酱油添加量为1%时，MGO、GO含量最高分别为9.94 μg/g protein、2.73 μg/g protein。混合添加时，与T1、T2、T3组相比，酱油减弱绵白糖对GO形成的促进作用，当酱油添加量为2%时抑制效果更加明显。

图2 酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼中MGO、GO含量的影响Fig.2 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on MGO, GO content in fried sturgeon patties

2.3 添加绵白糖与酱油对油炸鲟鱼饼荧光AGEs含量的影响

酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼荧光强度影响如图3所示。油炸鲟鱼饼荧光强度随绵白糖或酱油添加量的增加而增加。J1、J2组荧光强度显著高于T1、T2组（P＜0.05），表明酱油对油炸鲟鱼饼荧光强度的提高效果高于绵白糖。绵白糖与酱油的共同添加进一步提高油炸鲟鱼饼中荧光强度。当绵白糖添加量为3%、酱油添加量为2%时，荧光强度最高（28.17%/100 mg protein）。荧光AGEs形成途径之一是氨基与还原糖反应。因此，绵白糖促进荧光AGEs形成的原因是其通过热降解提供丰富的还原糖[22]，而酱油中丰富的氨基酸提供充足的游离氨基[24]，因此，无论是单独添加还是组合添加均能导致荧光AGEs形成增加，且受添加量影响。另外，从前文得出，2%酱油的添加降低油炸鲟鱼饼GO含量，推测酱油中的大部分游离氨基参与美拉德反应时可能不形成二羰基化合物，而直接重排形成晚期糖化终末产物，从而促进荧光AGEs产生。

图3 酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼荧光强度的影响Fig.3 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on fluorescence intensity in fried sturgeon patties

2.4 添加绵白糖与酱油对油炸鲟鱼饼CML、CEL、MG-H1 含量的影响

酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼CML、CEL、MG-H1含量影响如图4所示。绵白糖的添加促进CML、CEL、MG-H1形成，而酱油的添加促进CEL形成，却降低CML、MG-H1形成。无酱油添加时，绵白糖的添加量对CML影响较大。混合添加时，相较于绵白糖，酱油对CML形成的抑制效果占主导作用，而相较于酱油，绵白糖对MG-H1形成的促进效果占主导作用。

图4 酱油与绵白糖的添加对油炸鲟鱼饼中CML、CEL、MG-H1含量的影响Fig.4 Effects of the addition of soy sauce and soft white sugar on CML, CEL, MG-H1 content in fried sturgeon patties

CML与CEL是赖氨酸衍生产物，MG-H1是精氨酸衍生产物[25]。CML可以通过Amadori产物氧化产生，也可通过GO与赖氨酸残基反应产生；CEL通过MGO与赖氨酸残基反应产生；MG-H1通过MGO与精氨酸残基反应产生[26]。作者研究发现，绵白糖添加导致MGO、GO形成增加，因此绵白糖的添加造成鲟鱼饼CML、CEL、MG-H1含量增加。

油炸鲟鱼饼中AGEs形成受酱油添加量的影响，主要表现为低水平酱油添加会使油炸鲟鱼饼CML、CEL形成增加，高水平酱油添加会使油炸鲟鱼饼CML、MG-H1形成减少。推测低浓度酱油中的游离氨基与食品体系中的游离羰基反应并占主导作用，并且酱油中的游离氨基还能与MGO、GO反应，使得部分AGEs含量升高，另外，酱油中多糖化合物的存在也可能促进食品体系中美拉德反应的发生；而酱油中同时含有丰富的大豆异黄酮等酚类化合物及抗氧化性肽，这些成分不仅能与食品体系产生的MGO、GO共价结合导致MGO、GO含量下降，其本身还具有一定的DPPH自由基清除能力和抗氧化能力[27-28]，有助于抑制食品体系中AGEs形成。与本研究相似，根据Mashilipa等[29]报道，酱油可以通过抗氧化、螯合金属离子等作用抑制AGEs形成；Ham等[27]发现酱油的Fe2+螯合活性和DPPH自由基清除活性可能是防止熟牛肉饼脂质氧化的主要机制，而脂质氧化正是AGEs形成途径之一。从前文可知，高水平酱油添加抑制GO的形成，推测酱油通过抑制GO与赖氨酸残基反应途径从而造成CML含量降低。另外，AGEs的形成包含有多条途径，包括美拉德反应、脂质氧化、糖降解[30]，作者推测，酱油对多条AGEs形成途径的影响效应是不同的，从而导致添加酱油后三种AGEs呈现不同的变化趋势。

当绵白糖与酱油混合添加时，酱油减弱绵白糖对GO、CML的促进效果，使GO和CML的形成受到抑制，推测由于酱油中的酚类物质及抗氧化肽在GO形成途径中与GO共价结合，而绵白糖降解产生GO的速度要慢于GO被共价结合的速度，因此同时添加会使GO含量降低，从而使CML含量降低。

3 结论

绵白糖或酱油的添加对油炸鲟鱼饼AGEs形成有影响，且两者共同添加对油炸鲟鱼饼AGEs含量具有显著交互作用（P＜0.05）。绵白糖的添加提高油炸鲟鱼饼AGEs（CML、CEL、MG-H1）及其前体物（糠氨酸、MGO、GO）含量，且绵白糖添加量与油炸鲟鱼饼AGEs及其前体物含量呈正相关，表明绵白糖在油炸鱼饼过程发生降解产生醛类物质和二羰基化合物，从而促进AGEs的形成。酱油的添加增加鲟鱼饼糠氨酸、荧光AGEs、CEL含量，但降低油炸鲟鱼饼CML、MG-H1含量，1%酱油的添加促进油炸鲟鱼饼MGO、GO产生，而2%酱油的添加降低油炸鲟鱼饼GO产生。绵白糖和酱油共同添加进一步促进油炸鲟鱼饼糠氨酸、荧光AGEs、MG-H1含量增加，而酱油对GO、CML形成的抑制占主导作用。

综上，在鲟鱼饼油炸过程中，添加过多的绵白糖会较大促进晚期糖化终末产物的形成，酱油由于其复杂成分导致其添加对不同AGEs标志物形成影响各异。因此，建议未来研究应关注调味料对鱼加工食品AGEs形成机制方面的研究。