基于网络药理学探讨桦褐孔菌降血糖功效成分及作用机制

武建平，李文兰, ，曲中原, ，孙向明，宋 辉，胡 扬，辛科颖，聂承冬

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学，药物工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨 150076）

糖尿病是世界最流行的慢性疾病之一，已经发展为影响人类健康的第三大“杀手”。2019年国际糖尿病联盟（IDF）发布的数据显示，2019年全球20～79岁成年人中约4.63亿患糖尿病，占全部人口的1/11，其中我国糖尿病患者达1.1亿，为全球首位[1]。目前，针对糖尿病尚无特效疗法，仍以预防和控制为主。临床上运用二甲双胍片、阿卡波糖片等西药治疗糖尿病，虽然疗效显著，但都具有较明显的副作用和药物依赖性。中医整体识病，综合防治，在防止或减缓糖尿病并发症的发生发展方面具有独特优势[2]。科学研究表明糖尿病的发生发展和饮食息息相关，采用药膳疗法改善糖尿病病症，辅助治疗糖尿病越来越受到认可。因此，寻找能预防和治疗糖尿病的药食两用中药已成为研究的热点。

桦褐孔菌（Inonotus obliquus（Fr.）Pilat）是锈革菌科寄生于寒带白桦树上药食两用的珍贵真菌药材，主要分布于北美北部、芬兰、波兰、俄罗斯、中国黑龙江、吉林长白山等地区，含有多糖、桦褐孔菌素、萜类、多酚类及木脂素等多种成分[3]。桦褐孔菌具有治疗糖尿病、抗癌等作用，被俄罗斯、日本、韩国等国家广泛认可。美国FDA称其为草药之王。俄罗斯批准将其产品作为伏龙芝军事学院军官、士兵的营养餐。桦褐孔菌味苦、气平、无毒，具有滋阴生津、健脾和胃、滋肝补肾等作用[4]。临床和药效学研究均表明桦褐孔菌具有良好的降血糖功效[5]。张苗等[6]基于糖尿病大鼠模型发现，桦褐孔菌通过改善胰岛萎缩和降低胰腺细胞空泡化程度等，起到了调节血糖的功效。刘向辉[7]研究发现桦褐孔菌的水提物和醇提物通过提高小鼠体力和机体抗氧化能力，调节血脂代谢，抑制炎性反应，缓解外周神经病变等症状，对实验性Ⅱ型糖尿病模型小鼠起到了显著的降血糖功效；王秋爽[8]研究表明桦褐孔菌提取物对多种造模方法建立的Ⅱ型糖尿病模型大鼠均具有良好的血糖调节作用。在此实验中还发现桦褐孔菌对被破坏的胰岛细胞具有修复作用。综上所述，桦褐孔菌降血糖的功效显著且安全稳定，具有极大的保健品开发价值。但截至目前，桦褐孔菌功效成分研究较为薄弱，质量评价标准尚未建立。故本文基于网络药理学[9-10]和分子对接模拟实验对桦褐孔菌的功效成分进行筛选，阐明化学成分-核心靶点-通路相互作用关系，探究其可能分子机制，为桦褐孔菌产业发展提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 桦褐孔菌主要成分的筛选

从中国知网（https://www.cnki.net/）、谷歌学术（https://scholar.google.com/）、ScienceDirect（https://www.sciencedirect.com/）、Springer Link（https://link.springer.com）、Pubmed（http://pubmed.com.cutestat.com）[11-12]和TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）等数据库中收集有关桦褐孔菌文献，提取桦褐孔菌文献中化学成分信息并进行整理，去除具有重复结构的不同名称成分，进行汇总。再利用

Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com）和ADMETlab（http://admet.scbdd.com）等数据库平台验证其化学成分结构，并对其成分分子结构进行确证[13]，将化合物保存为“SDF”或“MOL2”格式文件，绘制桦褐孔菌化学成分名称和成分结构的Excel表，最终得到桦褐孔菌的主要成分。

1.2 桦褐孔菌主要成分降血糖靶点的筛选

利用Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[14]数据库获取桦褐孔菌中主要成分的作用靶点，设置参数，species：Homo sapiens，其余参数为默认设置，进行Swiss Target Prediction，得到各成分靶点，基于Uniprot工具（https://www.uniprot.org）进行靶点信息校正，筛选出species为Homo sapiens靶点，再经过校对去重后，得到桦褐孔菌主要成分的靶点信息。

桦褐孔菌以“Diabetes”为关键词，在DisGeNET（v7.0）数据库（https://www.disgenet.org/）[15]、GAD数据库[16]、OMIM数据库（http://www.omim.org/）[17]中收集降血糖相关基因，将挖掘得到的基因与药物靶点基因共同映射，从而筛选出桦褐孔菌降血糖的作用靶点。

1.3 作用靶点-主要成分网络的构建

将桦褐孔菌的主要成分和降血糖作用靶点导入Cytoscape（3.7.2）软件[18]，构建成分-靶点相互作用网络。并基于网络节点拓扑结构特征值最大自由度和自由度（free degree）筛选核心网络[19]，筛选出桦褐孔菌降血糖的主要成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

将桦褐孔菌降血糖作用靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl）[20]，设置参数，species：Homo sapiens，得到蛋白相互作用关系，导入Cytoscape，构建桦褐孔菌降血糖的蛋白-蛋白相互作用网络（PPI），并基于degree值进行排序整理。

1.5 核心靶点富集分析与可视化

采用DAVID 6.8平台（https://david. ncifcrf.gov/）[21]，对桦褐孔菌降血糖靶点进行基因的生物过程（Gene Ontology，简称GO）富集分析与信号通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，简称KEGG）富集分析，GO富集分析通过GraphPad Prism 8进行可视化，KEGG富集分析通过Origin2019对通路进行Bubble+Color Mapped图可视化分析，并使用KEGG映射器构建路径图（https://www.kegg.jp/kegg/tool/map_pathway2.html）

1.6 分子对接模拟

将1.3项下筛选出的主要成分的“SDF”或“MOL2”格式文件导入Chem3D 18.0进行优化，统一格式；将1.3项下筛选的主要蛋白靶点通过PDB数据库（http://www.rcsb.org），选择其最佳蛋白晶体结构，并下载其“PDB”格式文件。配体分子导入PyRx软件[22]进行能量最小化处理，选择“Energy Minimization Parameters”，参数设置：Force Fielduff；Optimization Algorithm-Conjugate Gradients；Total number of steps-200；Number of steps for update-1；Stop if energy difference is less than-0.001。蛋白导入Auto Dock Tools，进行除水、加氢，原子类型设为Assign AD4 type。将已进行处理的配体分子导入PyRx软件的Ligands选项；蛋白导入Macromolecules选项，设置Exhaustiveness: 50，进行Run Vina等待计算结果[23]。在输出结果中，RMSD lower bound和RMSD upper bound越低，Predicted binding Affinity（自由能）的数值越负，表明所预测的大分子和配体之间的结合力越强，Predicted binding Affinity作为打分系统[22]。

1.7 桦褐孔菌功效成分的分析预测

对“1.6项”中主要成分的分子对接打分值与各靶点的阳性对照组配体的分子对接打分值进行对比[22]，并结合桦褐孔菌功效成分的相关文献，进行筛选，最终得到桦褐孔菌降血糖的功效成分。最后基于PLIP（Protein Ligand Interaction Profiler）识别靶点及其配体之间的非共价相互作用，提供有关结合特性的原子级信息[24]，通过PyMOL2.1.1展示其结合方式。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌主要成分的筛选

从国内外数据库中收集有关桦褐孔菌文献，提取桦褐孔菌文献中化学成分信息并进行整理汇总，最终确定85个桦褐孔菌的主要成分，见表1。

表1 桦褐孔菌中的化学成分信息Table 1 Chemical constituents of Inonotus obliquus

续表 1

2.2 桦褐孔菌主要成分降血糖靶点的筛选

通过Swiss Target Prediction预测确认了各个桦褐孔菌主要成分降血糖相关靶点，去重，共得到580个基因靶点，见图1。依据DisGeNET（v7.0）数据库、GAD数据库和OMIM数据库挖掘得到降血糖相关基因，去重后得到823个，将降血糖相关基因与药物靶点基因共同映射筛选出124个桦褐孔菌降血糖的作用靶点。

2.3 作用靶点-主要成分网络的构建

以124个降血糖靶基因作为治疗糖尿病靶点，建立桦褐孔菌化合物-降血糖靶点网络，由图1的网络拓扑学结构数据得到成分中位度数为40，筛选出大于2倍中位数的成分，度值（degree）＞80的化合物，一共有20个：25,26-二羟维生素 D（25,26-dihydroxyvitamin D）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、桦褐孔菌烷D（inonotusane D）、桦褐孔菌烷F（inonotusane F）、桦褐孔菌酸（Inonotusic acid）、桦褐孔菌醇A（inonotusol A）、桦褐孔菌醇B（inonotusol B）、桦褐孔菌醇C（inonotusol C）、桦褐孔菌醇D（inonotusol D）、桦褐孔菌醇E（inonotusol E）、桦褐孔菌醇G（inonotusol G）、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、spiroinonotsuoxotriol B、栓菌酸（trametenolic acid）、桦褐孔菌醇（inotodiol）和羊毛甾醇（lanosterol），这些可能是桦褐孔菌中主要的降血糖功效成分。

图1 桦褐孔菌的成分-靶点相互作用网络Fig.1 Compounds-Targets network of Inonotus obliquus

2.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建与分析

桦褐孔菌降血糖蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）分析中共有291个Edge，124个Node，具体见图2。因Node平均度数为4，故核心靶点的筛选条件为Degree＞8，最终得到21个核心靶点，这些核心靶点与其余蛋白相互作用更强，在该PPI网络中发挥了极其关键的作用，具体核心靶点及拓扑参数见表2。

图2 桦褐孔菌降血糖蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）Fig.2 PPI network of Inonotus obliquus

表2 核心靶点及拓扑参数Table 2 Core targets and topological parameters

2.5 核心靶点富集分析与可视化

采用DAVID数据库对桦褐孔菌主要成分降血糖靶点进行GO和KEGG分析。GO富集分析中，细胞生物过程富集的基因数较多，FDR值较低，说明桦褐孔菌主要通过调节以下生物过程发挥降血糖作用。根据FDR＜0.05，筛选出细胞生物过程（Bioprogress，简称为BP，如：对含氧化合物的反应、对氮化合物的响应、脂质代谢过程的正调控和活性氧代谢过程的正调控等）1143个，细胞组成（cell components，简称为CC，如：质膜、细胞膜和胞质部分等）15个，分子功能（Molecular Function，简称为MF，如：G蛋白偶联肽受体活性、肽受体活性和胰岛素受体底物结合等）58个，结果如图3（根据Count排序，取前10）。KEGG分析中有89条信号通路（Pathway），其中包括多条降血糖信号通路如Insulin resistance（胰岛素抵抗）、Type II diabetes mellitus（II型糖尿病）、Insulin signaling pathway（胰岛素信号通路）和Type I diabetes mellitus（I型糖尿病）等，根据靶标命中数量进行排序，对前15条通路进行可视化处理，见图4。

图3 桦褐孔菌降血糖靶点生物过程（GO）富集分析Fig.3 Enrichment analysis of anti-tumor target bioprocess（GO）in Inonotus obliquus

图4 桦褐孔菌主要靶点KEGG富集通路气泡图Fig.4 Bubble map of enrichment pathways of the main targets in Inonotus obliquus

根据KEGG通路分析，89条通路中90%通路均与降血糖相关。Insulin resistance通路共有11个靶基因；Type II diabetes mellitus通路共有6个靶基因；Insulin signaling pathway通路共有5个靶基因；Type I diabetes mellitus通路共有3个靶基因有治疗作用。桦褐孔菌与Type I diabetes mellitus和Type II diabetes mellitus通路信号通路的靶点表示图，见图5。

图5 桦褐孔菌和Insulin resistance信号通路的相关靶点表示图Fig.5 Representation of the targets of Inonotus obliquus involved in the Insulin resistance

2.6 分子对接模拟

使用网络节点度值（degree）＞80的20个核心成分和网络节点度值（degree）＞10的9个潜在蛋白靶点（由于（degree）＜10靶点的接近度中心性均小于0.01，故不对其进行分子对接模拟）进行分子对接模拟，并对核心靶点晶体结构的原配体进行对照分析。原配体的RMSD和对接结果的RMSD分别进行模型表征对比，并以原配体的打分值作为阈值截断出候选化合物的活性范围，筛选出有效活性成分[25]。经PyRx对接，得到的数据通过热图分析（仅保留Predicted binding Affinity（kcal mol-1）的绝对值最高组）得到图6，通过图6数据可知打分值中小于6的4个仅占2.50%，9到6之间的92个占57.50%，对接打分中大于等于9的活性成分占64个占40.00%，这很好的说明了桦褐孔菌中的候选活性成分与核心靶点具有良好的结合活性[23]。

图6 分子对接分数的热图分析（kcal mol-1）Fig.6 Heat maps of molecular docking scores（kcal mol-1）

2.7 桦褐孔菌的功效成分分析

对2.6中20个主要成分通过分子对接进行筛选，对主要成分的分子对接打分值与各靶点的阳性对照组配体的分子对接打分值进行对比，并结合桦褐孔菌功效成分的相关文献[26]，进行筛选，最终得到的19个核心活性成分可作为桦褐孔菌的功效成分，分别 为25,26-dihydroxyvitamin D、inonotusane D、inonotusane F、inonotusic acid、inonotusol A、inonotusol B、inonotusol C、inonotusol D、inonotusol E、inonotusol G、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、inotodiol、lanosterol、spiroinonotsuoxotriol B和trametenolic acid，其结构见图7。通过总结活性成分的化学结构，发现都为萜类和甾体类成分，这说明萜类和甾体类成分可做为桦褐孔菌主要的功效成分。通过PLIP工具分析发现桦褐孔菌的降血糖功效可能是通过氢键连接和疏水作用与靶点结合实现的，见图8，图中仅显示对接活性中最好的4组成分与靶点结合作用模式，分别为trametenolic acid-AGTR1、inonotusol BCHRM2、inonotusone B-F2、spiroinonotsuoxotriol B-ADRA2B。19个核心活性成分中，除trametenolic acid外，均为三萜类成分，三萜类化合物是自然界中分布广泛、结构类型多样的一类重要的天然产物，具有降血糖、抗肿瘤、抗炎、降血脂等多种生物活性[27]。近年来，三萜类化合物的降血糖活性研究取得了较大进展，已成为抗糖尿病药物研究的重要先导化合物之一[28]。

图7 桦褐孔菌的功效成分Fig.7 Functional componentsof Inonotus obliquus

图8 活性蛋白质和活性化合物相互作用分析Fig.8 Analysis of the interaction between active proteins and active compounds

trametenolic acid-AGTR1，分子对接打分值为-10.4，其绝对值与原配体（-10.9）打分值的绝对值相近。由PHE-77A、LEU-81A、TRP-84A、VAL-108A、PRO-285A、ILE-288A和TYR-292A残基产生疏水相互作用，其形成一个大的疏水loop区，可以保证trametenolic acid稳定的嵌入此基团；氢键连接为TYR-35A、THR-88A、TYR-184A和GLN-267A残基。有研究表明[29]，在增加能量消耗实验中，AGTR1缺陷型小鼠表现出饮食诱导的体重增加，肥胖的减弱以及胰岛素抵抗减弱。该研究数据还表明，AGTR1可以调节脂肪细胞因子的产生，从而调节胰岛素抵抗。trametenolic acid本身为α-葡萄糖苷酶抑制剂[30]，推测其在桦褐孔菌中作为AGTR1的抑制剂，调控脂肪细胞因子的产生和减少胰岛素抵抗的产生。inonotusone B-F2分子对接打分值为-10.4。疏水相互作用残基为TRP-0A和GLU-192A，形成一个疏水loop区；氢键连接为GLY-193A残基。相比与前两组，结合能力较弱，但此组对接的绝对值远远大于原配体（-5.5）打分值的绝对值，说明也具有开发价值。inonotusone B本身常被做为α-葡萄糖苷酶抑制剂[31]。在II型糖尿病及其高血糖动物模型实验中，均观察到F2表达上调[32-33]。说明inonotusone B可能通过调节F2，减缓人体血糖的升高。

inonotusol B-CHRM2，分子对接打分值为-10.7，其绝对值大于原配体（-9.4）分子对接打分值的绝对值。由TYR-80A和THR-84A，PHE-181A和THR-187A，TYR-177A、TRP-422A和TYR-426A残基产生疏水相互作用，分别形成三个疏水loop区，使inonotusol B嵌入基因稳定；氢键连接为TYR-80A、ILE-178A和ASN-419A残基。相对于trametenolic acid-AGTR1试验组，本组由于疏水口袋更多，可保证inonotusol B更稳定地在CHRM2中嵌住。inonotusol B可降低经过低强度体外冲击波疗法（lowintensity extracorporeal shockwave therapy）治疗后II型糖尿病大鼠的CHRM2表达，表明CHRM2与糖尿病有一定的关联，推测inonotusol B通过降低CHRM2表达，从而达到治疗糖尿病的目的。

spiroinonotsuoxotriol B-ADRA2B分子对接打分值为-11.6，其绝对值远远大于原配体（-7.0）打分值的绝对值。疏水相互作用残基为TYR-59B、ALA-60B、THR-274B和TRP-332B，形成一个大的疏水loop区；氢键连接为MET-61B、ARG-150B、ILE-232B、SER-316B、LEU-318B残基。此组对接有一个极大的疏水口袋，还有5个氢键缔合，相比前3组而言，本组试验的对接最稳定，结合效果最好。基于临床统计和动物实验表明，ADRB2基因的表达与2型糖尿病、肥胖症的产生有直接关系[34]，说明spiroinonotsuoxotriol B可能通过降低ADRB2表达，从而直接减少2型糖尿病和肥胖症的产生。inonotusol B和spiroinonotsuoxotriol B都具有极好的调节血糖的潜在能力，但截至目前还未见这两个成分相关的降血糖研究报道，故本课题组后期实验可能会对其进行进一步的实验验证。

3 讨论与结论

本研究采用网络药理学和分子对接试验揭示桦褐孔菌降血糖的功效成分和作用机制。通过构建桦褐孔菌“化学成分-靶点”网络及分子对接试验，筛选得到19个活性成分，分别为25,26-dihydroxyvitamin D、inonotusane D、inonotusane F、inonotusic acid、inonotusol A、inonotusol B、inonotusol C、inonotusol D、inonotusol E、inonotusol G、inonotusone A、inonotusone B、inonotusone C、inonotusone D、inonotusone E、inotodiol、lanosterol、spiroinonotsuoxotriol B和trametenolic acid。有文 献报道[31]，在体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价实验中inonotusone A（IC50值：107.2±5.1）、inonotusone B（IC50值：54.8±3.8）和inonotusone E（IC50值：68.3±2.5）表现出了良好的活性，且IC50值均低于阳性对照的阿卡波糖（IC50值：657.8±42.1）。19个活性成分中有17个 与inonotusone A、inonotusone B和inonotusone E结构极其相似。通过竞争性抑制、非竞争性抑制与反竞争抑制作用等研究还发现这一类成分与临床使用药物阿卡波糖作用模式相同（α-葡萄糖苷酶抑制剂，主要用于调节血糖），可作为竞争性抑制剂，为α-葡萄糖苷酶抑制剂的研发提供潜在的先导结构。黄盼盼等[35]发现桦褐孔菌中栓菌酸、桦褐孔菌醇和羊毛甾醇等羊毛甾烷型三萜类成分对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有良好的抑制活性，且IC50值均低于阳性对照的阿卡波糖，本文桦褐孔菌的19个活性成分中包括栓菌酸、桦褐孔菌醇和羊毛甾醇，其余成分中15个母核均为羊毛甾烷型三萜类成分，推测均具有降血糖的功效。

由PPI网络筛选出21个桦褐孔菌降血糖的核心靶点，分别为AKT1、AGTR1、ADRA2B、HSP90AA1、TNF、F2、CHRM2、CCR5、NPY2R、NPY1R、OPRM1、LCK、MTNR1B、CCR2、PRKCB、DRD2、PRKCD、PRKCA、S1PR2、IL2、IKBKB。研究发现小鼠β细胞中活性AKT1的过表达实质上影响了胰腺细胞的大小和功能，可使细胞大小和总胰岛素质量显著增加，同时小鼠葡萄糖耐量提高，对实验性糖尿病的抵抗力增强[36]。有研究表明在肥胖的啮齿动物或人类受试者的脂肪组织中观察到了TNF-α产生增加，其被认为是肥胖相关的胰岛素抵抗和II型糖尿病的发病机理。说明TNF-α抑制剂可以作用于胰岛素抵抗通路，减轻胰岛素抵抗和减少II型糖尿病的发病[37]。通过实验发现人尿液中的F2与II型糖尿病发病风险呈负相关，超出了传统的风险因素，对确定重度糖尿病人群可能有用，同时F2也可用于降低II型糖尿病的风险[38]。有研究指出胰腺中CCR5的表达与胰岛炎、自发性I型糖尿病以及早期糖尿病有关，说明可以基于控制CCR5下调来减缓糖尿病的发生[39]。研究表明低剂量IL-2的使用在多种临床环境中均抑制了有害的免疫反应，现发现IL-2在I型糖尿病患者中，也有相似的抑制免疫作用。IL-2是通过多种内在机制对调节性T细胞进行选择性表达，调控I型糖尿病通路，从而达到了治疗I型糖尿病的作用。某些中药成分也可以加强IL-2的表达，从而达到更好的预防以及治疗I型糖尿病的目的[40]。根据KEGG通路分析，89条通路中90%通路均与降血糖相关。其中胰岛素抵抗通路共有11个靶基因；II型糖尿病信号通路共有6个靶基因；胰岛素信号通路共有5个靶基因；I型糖尿病信号通路共有3个靶基因，均与降血糖相关。

本研究基于网络药理学工具和分子对接模拟试验相结合的方法，确认桦褐孔菌降血糖活性成分，关键靶点和信号通路，以及推测出其可能分子作用机制[24,41]。基于文献大数据从桦褐孔菌中筛选出85个桦褐孔菌主要成分及其与降血糖相关靶点。基于网络药理学方法确认了25,26-dihydroxyvitamin D、

dibutyl phthalate、inonotusane D、inonotusic acid、inonotusol A和inonotusone A等共19个降血糖功效成分，确定AKT1、AGTR1、ADRA2B和HSP90AA1等共21个核心靶点，发现胰岛素信号通路与桦褐孔菌降血糖作用密切相关。基于分子对接模拟实验，发现桦褐孔菌的核心靶点和功效成分有极好的结合活性，分子对接模拟试验中还发现其活性成分多为萜类和甾体类成分，与靶标多以氢键作用和疏水作用方式结合，推测trametenolic acid、inonotusol B、inonotusone B、spiroinonotsuoxotriol B等19个对接活性较好成分为桦褐孔菌降血糖的核心功效成分，其中栓菌酸、桦褐孔菌醇、羊毛甾醇是目前可测易得，具有代表性的降血糖功效成分[42]。综上，本研究为桦褐孔菌降血糖功效成分及其作用机制研究提供了理论参考和线索，为进一步控制和评价桦褐孔菌及其相关保健食品、药品开发提供理论支持。