UPLC-MS/MS分析牛肉红朱橘成熟果实多酚类化合物积累特征

李文云，韩秀梅，柏自琴，罗 怿，王小柯，林 乾，李金强，马玉华

（贵州省农业科学院果树科学研究所，贵州贵阳 550006）

柑橘主栽类型主要包括宽皮柑橘、柚类、橙类、柠檬等，不仅果形优美、酸甜爽口、香味浓郁，还富含多种生物活性成分，其中多酚类化合物是柑橘最常见的一类生物活性成分[1]。多酚类化合物广泛存在于根、茎、叶、花、果实和种子中，泛指化学结构中具有苯环和多个酚基团的一类次生代谢产物的总称，主要包括类黄酮、木质素、香豆素、酚酸、苯醌等[2-4]。多酚类化合物不仅与园艺产品外观、产量、营养品质、抗性和适应性等密切相关，在人体健康方面也发挥着重要作用，被称为人体“第七类营养素”，但人体自身不能合成，需从食物中摄取。多酚类化合物通常以抗氧化剂的形式清除人体活性氧自由基、抑制细胞过氧化、保护细胞免受损伤[5]，在调解免疫活性、改善心血管功能、抗炎镇痛、抗癌等方面发挥多重药理活性，被广泛应用于功能食品、保健品、贮藏保鲜等领域[6]。随着社会进步和生活水平的提高，以及对大健康理念的认知加深，消费者更加注重对果实品质和功能性成分追求。因此，柑橘多酚类化合物因极具研究和应用价值而被广泛关注。

牛肉红朱橘是朱红橘的自然突变体，其果实呈橘红色，香味浓郁持久，是贵州地方特色柑橘品种[7-8]。本文以两个地方特色柑橘种质-朱红橘和红香柚为对照，利用UPLC-MS/MS比较分析多酚类化合物积累特征并筛选差异代谢物，探索牛肉红朱橘成熟果实多酚类化合物积累特征，以期为牛肉红朱橘生产栽培、营养评价和功能性成分挖掘利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉红朱橘（NRH）、朱红橘（ZHJ）、红香柚（HXY） 15年生，均采自贵州省惠水县烂坝林场，砧木为枳壳，栽培管理条件一致。选择长势良好、无病虫的植株3株，在树冠外围不同方位随机采摘健康、无病虫的成熟果实，带回实验室，用蒸馏水将果面清洗干净，将果实随机分成3组，设置3次生物学重复，分离果肉迅速用液氮速冻，置于-80 ℃超低温冰箱保存待测；甲醇、乙酸、乙腈等 色谱纯，均购自国药集团。

CBM30A超高效液相质谱 配有电喷雾离子源（ESI）和Analyst 1.6.3数据处理软件，日本岛津公司；QTRAP 6500串联质谱 美国ABI公司； HSS T3 C18色谱柱（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm） 美国Waters。

1.2 实验方法

1.2.1 代谢物提取 将真空冷冻干燥后的样品研磨成细碎的粉末，准确称取100 mg，并加入1.2 mL 70%甲醇溶液。震荡涡旋混匀，随后置于4 ℃冰箱过夜浸提，10000×g离心10 min，用注射器吸取上清。过0.22 μm的微孔滤膜于上样瓶中待测。

1.2.2 代谢物检测 参照Chen等[9]的方法，详细检测方法如下：

液相条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 μm, 2.1 mm×100 mm）。流动相A相为超纯水（含0.04%乙酸），B相为乙腈（含0.04%乙酸）。洗脱梯度为：0 min B相为5%，10 min内B相增加至95%，保持95% 1 min，11.00～11.10 min，B相降为5%并平衡至14 min。柱温设置为40 ℃，进样量2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源温度550 ℃，质谱电压5500 V，帘气30 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。

1.3 数据处理

利用二级谱信息对物质进行定性，利用质谱峰对物质进行峰面积积分[10]。利用R软件制作聚类热图用于分析代谢物相对丰度。基于OPLS-DA（Partial Least Squares Discrimination Analysis，偏最小二乘判别分析）模型，根据差异倍数值和VIP值（Variable Importance In Project，变量重要性投影）来筛选差异代谢物。满足VIP值≥1且Fold Change≥2或Fold Change≤0.05的物质即为差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 三个地方种质多酚类化合物积累特征分析

聚类热图分析结果表明，NRH、ZHJ和HXY明显区分开，说明三者代谢物存在明显差异，且同一种质三个生物学重复聚在一起，表明数据可靠（图1）。本研究共鉴定出493种物质（其中多酚类化合物约占60%），依次为类黄酮（Flavonoids）163种，酚酸（Phenolic acids）71种，氨基酸及其衍生物（Amino acids and derivatives）55种，木脂素和香豆素（Lignans and Coumarins）35种，脂质（Lipids）29种，核苷酸及其衍生物（Nucleotides and derivatives）27种，有机酸（Organic acids）27种，生物碱（Alkaloids）24种，萜类（Terpenoids）5种，醌类（Quinones）1种，鞣质（Tannins）1种，其它（Others）55种。

图1 聚类热图分析代谢物相对丰度Fig.1 Metabolites relative abundance analysis by heat map

从热图分析结果上我们还可以看出，NRH与ZHJ聚类在一起，相距更近，两者代谢物种类基本一致，差异主要在含量上；而与HXY代谢物种类和含量差异较大，在热图上距离相对较远。NRH检测到的物质数量最多（460种），ZHJ次之（457种），HXY最少（409种）。其中毛蕊异黄酮、木犀草素、2'-羟基金雀异黄素、表儿茶素、阿魏酸-4-羟基香豆素、4-羟基-7-氧甲基香豆素鼠李糖苷、7,8-二羟基-5,6,4'-三甲氧基黄酮、泽兰黄素、芹菜素-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、金雀异黄素-8-C-葡萄糖苷、橙皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-新橙皮苷-7-葡萄糖苷等多酚类化合物仅在NRH和ZHJ中检测到。而瑞香素、异莨菪亭、香柑醇、佛手柑内酯、花椒素、异欧前胡素、对香豆酰基腐胺、飞燕草素、异鼠李素-己糖丙二酸等多酚类化合物仅在HXY中检测到。

2.2 差异物质的鉴别与筛选

火山图分析结果表明（图2），NRH和HXY比较组筛选到287种差异代谢物，其中179种下调，108种上调。ZHJ和HXY比较组筛选到292种差异代谢物，其中194种下调，98种上调。ZHJ和NRH比较组仅筛选到54种差异代谢物，其中42种下调，12种上调。

图2 不同比较组差异代谢物火山图Fig.2 Volcano plot of differential metabolites in different comparison groups

韦恩图结果表明（图3），三个比较组共有的差异代谢物有29种（其中多酚类化合物占83%），具体物质信息见表1，其中类黄酮13种，香豆素6种，核苷酸及其衍生物2种，酚酸类2种，其它2种，氨基酸及其衍生物、木脂素、生物碱和醌类各1种。

表1 三个比较组共有差异代谢物Table 1 Common differential metabolites among three comparison groups

图3 韦恩图（Venn）展示三个比较组共有和特有差异代谢物Fig.3 Common and unique metabolites among three comparison groups explained by Venn

ZHJ和HXY比较组分别筛选到19种差异代谢物（其中多酚类化合物占42%）（图3，表2），其中类黄酮、核苷酸及其衍生物、酚酸类、脂质和其它类均为3种，生物碱2种，有机酸和氨基酸及其衍生物各1种。NRH和HXY比较组筛选到14种特异代谢物（其中多酚类化合物占57%），其中酚酸类5种，有机酸、类黄酮和脂质均为2种，核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、木脂素各1种。ZHJ和NRH比较组筛选到11种差异代谢物（其中多酚类化合物占91%），其中类黄酮5种，酚酸类4种，有机酸1种，木脂素和香豆素1种。

表2 各比较组筛选到的特异代谢物Table 2 Specific metabolites selected in each comparison group

2.3 差异代谢物功能注释和富集分析

差异代谢物KEGG富集分析表明，NRH vs HXY比较组差异代谢物参与了苯丙烷合成、异黄酮合成、黄烷酮和黄酮醇合成等20个生物过程（图4A）。ZHJ vs HXY比较组差异代谢物参与了氨基酸合成与降解、氧化磷酸化、丙酸代谢、苯丙烷合成、黄烷酮和黄酮醇合成等20个生物过程（图4B）。ZHJ vs NRH比较组差异代谢物参与了黄烷酮和黄酮醇合成、牛磺酸代谢、核黄素代谢、苯丙烷合成、嘧啶合成、嘌呤合成等11个生物合成过程（图4C）。

图4 差异代谢物KEGG富集分析Fig.4 Differential metabolites enrichment analysis by KEGG

3 讨论

多酚类化合物是广泛存在于植物体的一类重要的天然抗氧化物质，对人体健康发挥着重要作用[11-12]，目前已经鉴定分离出8000余种[13]。多酚类化合物属于苯丙烷的衍生物，糖酵解途径和戊酸磷酸途径生成的中间产物经莽草酸途径形成前体物质苯丙氨酸，随后通过苯丙烷代谢途径进一步形成类黄酮、木质素、香豆素、酚酸、生物碱、鞣质等[14-15]。其中类黄酮是多酚类化合物最大一个亚类，也是柑橘研究最广泛深入的一类生物活性成分，根据苯环位置和羟基个数分为黄烷酮、黄酮、黄酮醇和花青苷等，游离态的苷元较少，大部分经糖基化、异戊烯基化和甲基化等修饰作用以衍生物的的形式存在，如橙皮苷、柚皮苷、柚皮芸香苷、新橙皮苷等[16-18]。随着消费者对优质、健康果品需求不断升级，该类物质积累特征、开发和创新利用一直是育种者关注的热点。

多酚类化合物受品种、生长发育阶段、组织部位、生态条件等内在和外在多种因素影响下，共同形成独特的积累特征[19-20]。其中，品种是影响多酚类化合物组成和含量决定性因素之一，如咖啡酸、食子酸、原儿茶酸、肉桂酸阿魏酸和鞣花酸等酚酸在不同枣品种间存在显著差异[21]。作为苹果主要抗氧化成分的多酚类物质在各个品种间差异显著[22]。郑洁等[23]分析椪柑、砂糖橘、纽荷尔脐橙、鸡尾葡萄柚、柠檬、金柑等品种果实中酚酸和类黄酮组分时发现，椪柑和鸡尾葡萄柚果皮总酚含量最高，金柑最低；类黄酮在鸡尾葡萄柚果皮中含量最高，其次是椪柑和纽荷尔脐橙。本研究结果表明三个地方特色柑橘种质果实中多酚类化合物种类和相对含量呈现出种质特异，遗传背景相似的种质，其代谢物种类和相对含量也更为接近。具体表现为同为宽皮柑橘的NRH和ZHJ，代谢物种类和相对含量更为接近，两者筛选到的差异代谢物较少；两者与柚类HXY代谢物种类和相对含量差异明显。进一步说明代谢物种类与种质类型间存在密切联系。

类黄酮是柑橘果实中含量丰富的一类多酚类化合物，不仅影响果实着色和风味，对果实营养价值也具有重要影响，是果实品质的重要组成部分[4]。根据化学结构类黄酮可分为查尔酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇和花青素等，大部分类黄酮苷元（如柚皮素、橙皮素、香叶木素、山奈酚等）形成后，进一步经过糖基化、酰基化和甲基化等修饰形成稳定的产物，柑橘中类黄酮主要修饰方式为糖基化[24]，如检测到的芸香柚皮苷、柚皮苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷等。除检测到大量的类黄酮糖基化产物外，同样检测到在柑橘中特异积累的多甲氧基黄酮（含2个或2个以上甲氧基），如5,6-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮、5,2'-二羟基-7,8-二甲氧基黄酮、单羟基三甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮和5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮等，这类物质在抗炎、抗氧化和抗肿瘤等方面具有广泛的药理作用[25-26]。

除类黄酮外，酚酸类也是本研究中检测到较丰富的一类化合物，其泛指同一苯环上有若干个羟基的一类化合物的总称。柑橘中主要以酰胺、酯或糖苷结合态存在，游离态的较少[27]。如本研究中检测到的香豆酸、芥子酸甲酯、原儿茶酸-4-葡萄糖苷、丁香酸-O-葡萄糖苷、2,5-二羟基苯甲酸-O-己糖苷和1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖等。

柑橘多酚类化合物种类丰富，从头合成途径较长，涉及上下游的多条代谢途径，如上游的糖酵解、磷酸烯醇式丙酮酸和戊酸磷酸途径等，下游的莽草酸、苯丙烷、甲羟戊酸等多条生物代谢途径[28-29]。以及苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）[30]、4-香豆酰-CoA-连接酶（4-coumarate coenzyme A ligase, 4CL）[31]、查耳酮合成酶（Chalcone synthase, CHS）[32]和肉桂酸-4-羟基化酶（Cinnamate 4-hydroxylase, C4H）[33]等多个限速酶的作用。各品种间生物活性成分种类和含量的差异，具体是哪些代谢物、代谢途径、关键结构基因或调解基因起主导作用，还有待从结构基因、转录调控、环境调控、库源供应等多个层面深入研究。