云南某地区猪嗜血支原体的诊断及生物信息学分析

周玉照，张小苗*，李 明 ，张雅娜，张 雷

（1.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003； 2.云南神农农业产业集团股份有限公司，云南 昆明）

猪嗜血支原体是一种寄生于猪红细胞表面、血浆及骨髓内的微生物。猪感染后，多数情况下不表现临床症状，呈隐性感染；当机体抵抗力降低或严重感染时，可使红细胞变形、裂解，引起猪发生以贫血、黄疸、发热、母猪繁殖障碍、受胎率低、不发情、流产和死胎等为主要症状的疾病，称为猪附红细胞体病（E.suis）[1]。猪嗜血支原体感染及引起的猪附红细胞体病在许多国家和地区均有报道，给养猪业造成巨大经济损失[2]。

所以弄清猪嗜血支原体病的流行情况，对于该病的防治具有重要的指导意义。该病分布于数十个国家，如：印度、伊朗、朝鲜、日本、英国、法国、挪威、比利时、埃及、南非、巴西、美国、澳大利亚等国，几乎遍布亚洲、欧洲、美洲、大洋洲[3]。根据1990～2008年间公开发表的猪嗜血支原体病的流行病学调查和病例报告，我国已有26个省区存在猪嗜血支原体病，在中国的东北、华北、西北、中南、西南、东南均存在猪嗜血支原体病的流行，且在22篇猪嗜血支原体病流行病学调查中，样品感染率在50 % 以上 的有19篇，占总篇数的86.36 %，这说明猪嗜血支原体病在中国的地域分布十分广泛[4]。而云南地区猪嗜血支原体病的流行情况目前还没有报告过，本试验从云南某地区采集疑似猪嗜血支原体引起的猪附红细胞体病的100份样品进行血液涂片镜检、PCR鉴定、同源性比对与遗传进化分析。从而了解到云南地区猪嗜血支原体的感染情况，这为该病的治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 从云南某地区采集疑似猪嗜血支原体病患猪的全血98份，精液2份，共100份。

1.1.2 试验材料 血液DNA小量提取试剂盒、rTaq酶、Taq Buffer、ddH2O、大肠杆菌DH5α、pMDl9-T载体、DNA Marker DL 2000均购自宝生物工程（大连）有限公司，DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考GeneBank上公布 的猪嗜血支原体（猪附红细胞体）16S rRNA基因序列（GeneBank登录号：U88565.1），利用Primer 5.0软件分别设计合成用于扩增部分16S rRNA基因的引物。引物序列E.suis-F:5'-GACTC TCCAACTTGT-3', E.suis-R：5'-CATAATCAGTAA ACT-3'。引物由宝生物（大连）有限公司合成。

1.2.2 血液涂片镜检 将采集来的98份鲜血滴于载玻片上，用推片法制成血涂片，然后用瑞氏染色法对血涂片进行染色和镜检[5]。

1.2.3 PCR鉴定 采用血液DNA小量提取试剂盒分别提取100份样品中的DNA，应用 PCR方法对提取的DNA进行扩增，扩增体系为：DNA模板2 µl，上、下游引物各1 µl，DNA酶1 µl，dNTPs 1µl，Buffer 3 µl，ddH2O 16 µl。扩增程序为：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃ 变性60 s，60 ℃ 退火35 s，70 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃ 终延伸8 min。

1.2.4 PCR扩增序列测定及分析 用DNA回收试剂盒对与预期大小片段相符的条带进行胶回收，并与pMD19-T载体连接，连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，将阳性克隆重组质粒的菌液送宝生物（大连）有限公司进行序列测序，应用生物信息学软件DNAStar对获得的序列进行核苷酸同源性和遗传进化比对分析。

2 结果

2.1 血液涂片镜检结果

对98个血涂片进行瑞氏染色染色和镜检，结果有2份明显看到嗜血支原体在红细胞表面单个或成团聚集附着，被侵染的红细胞变形，多为多突起的齿轮状或星芒状（见图1）。

图1 血液涂片瑞氏染色结果

2.2 PCR扩增鉴定结果

将100份PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在33和55泳道上约541bp处出现扩增条带，其大小与预期的基本相符（见图2）。

图2 E.suis PCR扩增结果

2.3 PCR扩增序列同源性比对与遗传进化分析结果

将测序得到的序列分别命名为YN E.suis-1、YN E.suis-2，用DNAStar中的MegAlign软件与公布的猪嗜血支原体（猪附红细胞体）进行同源性比对和遗传进化分析，结果表明在云南某地区得到的YN E.suis-1、YN E.suis-2与E. suis的同源性在97.2 %～96.9 %，与E. wenyonii的同源性为85.8 %～90.4 %，与Mycoplasma suis同源性为86.6 %～95.9 %，与Mycoplasma ovis同源性为86.9 %～88.9 %，与Mycoplasma Sika同源性为90.4 %～91.7 %。从遗传进化看YN E.suis-1、YN E.suis-2与U88565、AF029394为同一分支，亲缘关系较近。说明云南存在猪嗜血支原体病的流行。

表1 系统发育分析的病原体各类信息表

图3 同源性比对结果

3 讨论

随着云南养殖业的快速发展及云南特殊的地理环境，猪嗜血支原体病也越来越严重，给养猪业带来巨大的经济损失，所以弄清云南地区猪嗜血支原体病的流行情况，对于该病的防制具有重要的指导意义。然而，对于大量猪嗜血支原体感染的数据，由于其不可培养的特性使诊断该病受到了限制，目前的研究揭示了其在猪群中的患病率大约为10 %～15%[6]。就针对于猪嗜血支原体病的诊断，主要有病原体血液涂片染色镜检、血清学补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等抗体检测以及PCR[3]。但血液涂片染色镜检常常受到血液里不明微生物、染料颗粒和非病原性物质等因素的干扰；血清学方法存在抗原纯度低、来源不足等缺点；PCR方法均是以16S rRNA的基因序列来建立，且特异性强[7]。本试验从云南某地区采集疑似猪嗜血支原体病患猪的100份样品进行血液涂片镜检、PCR鉴定，结果检测出2份阳性样品，其感染率为2 %。试验检测到的猪嗜血支原体感染率与猪嗜血支原体在猪群中的患病率（10 %～15 %）相比有所下降，说明云南地区对于猪嗜血支原体的防制效果明显。

图4 遗传进化分析结果

猪嗜血支原体病的发病模式具有明显的新趋势，主要以混合感染、继发感染为主，单一的感染发病极少[8]。该病虽然在夏季的发病率和死亡率仍然较高，但春、夏、秋、冬四个季节都可发病和死亡，特别是在冬季，没有蚊虫的传播仍然有本病的发生；这些因素说明本病发生的季节性已经不是很明显，这些因素可能是由于本病的传播途径的多样化[9]。猪嗜血支原体病预防应该以控制猪免疫抑制性疾病（猪蓝耳病、猪圆环病毒）和主要猪场疫病，减少应激，做好基础免疫，加强饲养管理，做好药物保健等为主[10]。

4 结论

云南某地区存在猪嗜血支原体引起的猪附红细胞体病流行，虽然感染率有所下降，但还是不能轻视，还应加强做好该病的防控。