寒温带落叶松倒木分解过程中的真菌组成和多样性差异分析

崔福星，杨立宾，，隋 心，黄庆阳，朱道光

（1.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省科学院 自然与生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080）

倒木的生态功能在物理、化学、生物作用下，通过腐朽和分解过程来实现，土壤微生物、土壤动物、节肢动物等是倒木分解的主要参与者。分解过程中倒木释放碳、氮、磷等养分，为分解者提供栖息地和营养来源。微生物不仅是倒木的主要分解者，也是消费者，同时也能够敏感、直观的反映倒木的分解速率和各种环境因素[4]。而不同植被、不同径级、不同部位（树皮、边材、心材）、不同的分解时间（分解阶段）的倒木以及倒木在生态系统中立地条件的差异等也会造成微生物组成和微生物生物量的差异[5-7]。传统的培养、分离鉴定等方法认为真菌是参与倒木分解的主要类群，主要包括腐朽菌、软腐菌、变色菌、霉菌等[3]。新一代高通量测序技术运用到微生物的鉴定和分析中，提高了我们对微生物组成结构和多样性的认识，也提高了微生物群落鉴定的准确性和可靠性[8]。

目前针对寒温带落叶松林倒木研究的报道主要包括倒木储量、养分含量、分解速率及温室气体排放等方面的相关研究，而针对落叶松倒木分解过程中的分解者——微生物的相关研究并不多见。因此，为明确真菌在倒木分解不同阶段的组成结构和多样性，为评价真菌在倒木分解过程中的作用和贡献，本研究以大兴安岭落叶松倒木为主要研究对象，采用高通量测序的方法研究不同分解阶段倒木上的真菌群落组成结构和多样性特征，以期为深入理解寒温带落叶松倒木的分解过程及影响因素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域概况

研究区域位于黑龙江省大兴安岭呼中国家自然保护区内，实验样地（51°49′01″～51°49′19″N，122°59′33″～123°00′03″E）位于2014年建成的25 hm2寒温带针叶林监测样地内。样地的地形平缓，海拔为847～974 m，年平均气温为-4℃，年平均降水量为458.3 mm，年平均相对湿度为71%，年平均蒸发量为911 mm[9]。土壤为典型棕色针叶林土，厚度为5～25 cm。植被的群落结构比较单一，主要是以落叶松为优势种的针叶林，其中乔木4 种，灌木37 种，草本127 种[9]。

1.2 研究方法

根据闫恩荣等[10]的研究，表1将不同腐烂程度的落叶松粗木质残体划分为5 个分解等级，分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级表示。2019年6月11日在样地中选择杜香-落叶松林阳坡地势平坦的样方，调查选取立地条件相似且储量最大的倒木（径级为20～30 cm）[11]，分别取5 个分解等级各3株的倒木混合样品（因落叶松Ⅳ、Ⅴ级分解等级的倒木无法准确确定树皮、边材和心材，所以从Ⅰ级到Ⅴ级倒木均采用树皮、边材和心材混合取样；对于Ⅰ～Ⅲ级分解等级的倒木，径向截取2 cm 的木段，Ⅳ～Ⅴ级分解等级的倒木取同样2 cm长度的样品装入布袋），去除泥土、根系、苔藓等附生物质做好标记后装于无菌样品袋内低温保存，尽快带回实验室分析。将每个样品分成两部分，一部分粉碎、研磨、混匀后于-80℃中储存，用于真菌多样性测定；另一部分用于基质物质和理化性质测定。

表1 倒木的分类系统Table 1 Classification system for Fallen logs

1.2.1 倒木理化性质测定测定

将采集的倒木样品粉碎，过60 目筛，于65℃条件下烘干至恒质量，存放于干燥环境中待测。总碳、总氮含量采用燃烧法，使用CN 元素分析仪（Multi N/C 2100S，德国耶拿分析仪器股份公司，德国）测定[9]；含水率含量采用烘干法测定[12]；纤维素含量采用重铬酸钾-碘量法[13]、半纤维素含量的测定采用碱液提取法[14]、木质素含量的测定采用Klason 法[15]。

1.2.2 DNA 提取与真菌ITS 基因扩增

改造小流域的雨水管网体系，与雨洪控制利用措施体系和河网体系相辅相成，控制建设地块雨水外排，并保证超标准雨水外排通畅。新建项目排水体制采用雨污分流制。已建项目采用因地制宜的排水体制，对无排水系统街巷或院落新建分流制排水系统，对有排水系统的进行系统改造。

倒木样品的真菌DNA 基因组采用试剂盒（Carlsbad,CA,USA）法提取。以50 ng DNA为模版，采用ITS1F/ITS2R（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA/GCTGCGTTCTTCATCGATGC）通用引物在V4～V5 高度可变区进行扩增[9]。

在预实验完成后，PCR 正式试验采用Trans Gen AP221-02：Trans Start Fastpfu DNA Polymerase，20 µL 反应体系为：4 µL 的5×FastPfu 缓冲液，2 µL 2.5 mmol·L-1的dNTP，0.8 µL 5 µmol·L-1的Primer F，0.8 µL 5 µmol·L-1的Primer R，0.4 µL 5 U·µL-1的Polymerase，0.2 µL 的BSA，10 ng 的DNA 模板，补超纯水（dd H2O）至20 µL[9]。

PCR 反应参数[9]：1×(3 minutes at 95℃)，循环数×(30 seconds at 95℃；30 seconds at 退火温度72℃；45 seconds at 72℃)，10 minutes at 72℃，10℃ until halted by user。用2%的琼脂糖电泳检测相同样本混合后的PCR 产物，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)凝胶回收试剂盒纯化PCR 产物。将纯化扩增产物等摩尔混合，构建Miseq 文库，使用Illumina MiSeq 平台测序[9]。物种分类采用unite 8.0/itself_fungi（Unite Release 8.0）的真菌数据库进行比对和鉴定。

1.2.3 生物信息学分析和数据处理

生物信息学分析由上海美吉生物医药科技有限公司的微生物多样性云分析V4.0 平台协助完成。使用Qiime（v1.8.0）软件过滤、拼接、去除嵌合体，以97%相似性为标准来划分操作分类单元（Operational taxonomic units,OUT）。物种的比对注释采用RDP classifier 贝叶斯算法，对OTU 代表序列进行置信度阈值为0.7 的分类学分析。使用mothur 软件进行Alpha 多样性指数分析和rarefaction 分析，分别用Coverage 指数、Sobs 指数和Ace 指数、Shannon 指数和Simpson指数表示测序深度、物种的多度、丰富度和均匀度。使用Qiime 计算Beta 多样性距离，基于Bray-Curtis 距离使用R 语言vegan 软件包进行进行非度量多维尺度（Non-metric multidimensional scaling,NMDS）分析和作图。环境因子关联分析采用R 包vegan 的基于距离的冗余分析（Distancebased redundancy analysis,db-RDA）。真菌的生态功能群分析采用FUNGuild 软件。作图采用R语言vegan 包和ggplot 包[9]。使用Excel 2010 和SPSS 19.0 软件对实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）和多重比较法（LSD）对倒木的总碳、总氮、含水率、碳氮比、纤维素、半纤维素、木质素含量的差异和显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 倒木养分含量分析

从表2可以看出，随着腐烂程度的增强，倒木的含水率从Ⅰ～Ⅴ级分解等级显著升高。倒木总氮含量，从Ⅰ～Ⅴ级分解等级逐渐升高，Ⅰ～Ⅳ级与分别Ⅴ级存在着显著性差异。总碳含量从Ⅰ～Ⅴ级逐渐降低Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级之间无显著性差异，但与Ⅰ级和Ⅴ级存在显著性差异。碳氮比从Ⅰ～Ⅴ级逐渐降低，其中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级之间无显著性差异，但与Ⅰ级和Ⅴ级存在显著性差异。

表2 不同分解等级的倒木理化性质比较†Table 2 Comparison of physical and chemical properties of fallen wood with different decomposition grades

倒木纤维素的质量分数从Ⅰ～Ⅴ级逐渐降低，Ⅰ级和Ⅱ级之间无显著性差异，Ⅲ、Ⅳ级和Ⅴ级之间存在显著性差异。倒木半纤维素的质量分数从Ⅰ～Ⅴ级逐渐降低，变化趋势与纤维素相同，Ⅰ～Ⅴ级之间呈显著性差异。倒木木质素的质量分数从Ⅰ～Ⅴ级逐渐升高，Ⅰ级和Ⅱ级之间无显著性差异，Ⅲ级和Ⅳ级之间无显著性差异，Ⅴ级倒木的木质素质量分数最高并与各组之间存在显著性差异。

2.2 样品测序结果及取样深度验证

通过优化过滤低质量序列后得到倒木样品真菌测序的有效序列总数为1 019 000 个，其中有效碱基数为272 601 633 个，有效序列长度平均为267.52 bp。倒木样品真菌的序列经拆分、去冗余后在97%相似度下进行OTU 聚类，共得到OTUs共825 种。

利用Sobs 多样性指数构建稀释性曲线，如图1所示。稀释性曲线均趋向平缓，趋于饱和；说明倒木的样品取样合理，测试的数据量也合理，置信度较高，能够真实准确地反映不同分解等级倒木样本的真菌群落状况，而增加真菌的测序数量对发现新的OTU 贡献率比较小。

图1 相似度为0.97 条件下样品的稀释性曲线Fig.1 Dilution curve of samples with similarity of 0.97

如图2所示，不同腐烂程度倒木真菌OTUs 总数Ⅴ级＞Ⅳ级＞Ⅱ级＞Ⅰ级＞Ⅲ级，分别为431、269、256、213、161。5 个分解等级倒木真菌共同所有的OTUs 数目为13 个，Ⅰ级和Ⅱ级为116，Ⅰ级和Ⅲ级为62，Ⅰ级和Ⅳ级为58，Ⅰ级和Ⅴ级为50，Ⅱ级和Ⅲ级为69，Ⅱ级和Ⅳ级为66，Ⅱ级和Ⅴ级为75，Ⅲ级和Ⅳ级为78，Ⅲ级和Ⅴ级为61，Ⅳ级和Ⅴ级为120。共有OTUs 数目表示各样地彼此之间存在不同的相似性，结果可以看出，Ⅰ级和Ⅱ级、Ⅳ级和Ⅴ级分别具有相同的OTUs，数目更多，说明其相似性更大。此外独有的OTUsⅠ级为56，Ⅱ级为79，Ⅲ级为24，Ⅳ级为85，Ⅴ级为258。

图2 各分解等级倒木上真菌的OTUs 比较Fig.2 OTUs comparison of Fungi on fallen wood with different decomposition grades

2.3 倒木上的真菌群落分布特征分析

在相似水平为97%的条件下，对OTUs 的代表序列做分类学分析，共鉴定9 门31 纲90 目178科291 属425 种。在门分类水平上分属于球囊霉门Glomeromycota、子囊菌门Ascomycota、毛霉门Mucoromycota、捕虫霉亚门Zoopagomycota、隐真菌门Rozellomycota、被孢霉门Mortierellomycota、担子霉门Basidiobolomycota、担子菌门Basidiomycota、壶菌门Chytridiomycota 和目前未能鉴定划分的真菌类群。由表3可以看出，5 个分解等级倒木上的真菌在门分类水平上以子囊菌门为共有的主要优势门（相对丰度≥10%），真菌组成上各有不同，Ⅰ级主要为担子菌门、子囊菌门和未定义的真菌类群，Ⅱ和Ⅲ级中主要为子囊菌门、Ⅳ和Ⅴ级主要为担子菌门、子囊菌门、被孢霉门。此外，5 个级别倒木在门分类水平上真菌组成的相对丰度存在不同的差异性。

表3 门分类水平上的微生物群落组成和相对丰度Table 3 Microbial community composition and relative abundance at the phylum taxonomic level

2.4 Alpha 多样性指数分析

对不同分解等级的倒木上真菌ITS rDNA 的Alpha 多样性指数进行ANOVA 分析，从表4可以看出，各分解等级的Coverage 指数为0.99，趋近于1，说明样本中序列被测出的概率高，反映本次测序结果能够代表样本中微生物的真实情况。真菌Ace 指数Ⅴ级指数最高，Ⅲ级指数最低，Ⅰ级和Ⅱ级之间无显著性差异，但与其它各级存在显著性差异，说明各样品中的真菌物种组成总数存在差异。Shannon 指数分为3 组，第一组（Ⅰ级和Ⅱ级）之间无显著性差异，第二组（Ⅳ级和Ⅴ级）之间无显著性差异，第三组为Ⅲ级，3 组之间存在显著性差异，说明各组之间的丰富度不同。Simpsoneven 指数Ⅱ级和Ⅳ级较低且与其它各组呈显著性差异，说明其均匀度最高。

表4 相似度为0.97 条件下各倒木样品多样性指数分析Table 4 Diversity index analysis of fallen wood samples of different decomposition grades with similarity of 0.97

2.5 Beta 多样性分析

基于Bray-Curtis 距离对不同分解等级的倒木上真菌群落组成进行非度量多维尺度分析，从图3可以看出，X 轴上分为两大组，第一组在X 轴的负方向上（Ⅰ～Ⅱ级），第二组在X 轴的正方向上（Ⅲ～Ⅴ级）；此外，第一组的Ⅰ级和Ⅱ级被置信椭圆囊括，而第二组中的Ⅲ级、Ⅳ级（Ⅲ级和Ⅳ级之间距离较小）又与Ⅴ级分开，分别位于第四和第一象限。结果表明Ⅰ级和Ⅱ级的真菌组成更加相似，Ⅲ级和Ⅳ级的组成相似。检验NMDS 分析结果优劣的值为0.085＜0.1，可以认为是一个好的排序。

图3 各分解等级倒木的真菌Beta 多样性分析Fig.3 Beta diversity analysis of Fungi on fallen wood at different decomposition grades

2.6 冗余分析

db-RDA 排序结果由图4可知，两轴的解释率分别为14.41%和6.94%，累计解释率为21.35%。全部样品被坐标轴分为3 组，Ⅰ级为一组（在第三象限），Ⅱ级和Ⅲ级为一组（在第四象限），Ⅳ级和Ⅴ级为一组（在第二象限）。子囊菌门与总碳含量和半纤维素含量正相关，与其它负相关；担子菌门和被孢霉门与含水率、纤维素、木质素、总氮含量正相关，与总碳含量和半纤维素含量负相关。

图4 基于倒木真菌门水平和养分因子的冗余分析Fig.4 RDA based on the Fungi phylum level and nutrient factors of fallen wood

2.7 倒木上真菌的生态功能群

使用FUNGuild 软件（Fungi functional guild）对真菌进行功能分类，结果显示（图5）5 个分解等级的倒木上相对丰度≥1%的真菌可分为5 个生态功能群组；分别是植物病原菌、腐生菌、动-植物病原菌、内生菌和外生菌。在科分类水平上分为19 个科，其中长喙壳菌科Ophiostomataceae、角担菌科Ceratocystidaceae、柔膜菌科Helotiaceae、皮盘菌科Dermateaceae、黑星菌科Venturiaceae被划分为植物病原菌生态功能群组，晶杯菌科Hyaloscyphaceae、发菌科Trichocomaceae、皮壳菌科Botryobasidiaceae、珊瑚菌科Clavariaceae、肉座菌目下未定义的科Hypocreales、黑酵母菌Herpotrichiellaceae、被孢霉科Mortierellaceae、古根菌科Archaeorhizomycetaceae 被划分为腐生菌生态功能群组，毛孢壳科Coniochaetaceae 被划分为动-植物病原菌生态功能群组，柔膜菌目下未定义的科Helotiales 和水盘菌科Vibrisseaceae 被划分为内生菌生态功能群组，鸡油菌目下未定义的科Cantharellales、Chaetosphaeriaceae 和红菇科Russulaceae 被划分为外生菌生态功能群组。

从图5看以看出，5 个分解等级倒木上的真菌生态功能群各不相同。其中Ⅰ级主要是以长喙壳菌科、角担菌科、柔膜菌科为主的植物病原菌和以晶杯菌科为主的腐生菌功能群。Ⅱ级主要以长喙壳菌科、柔膜菌科、皮盘菌科为主的植物病原菌，发菌科为主的腐生菌和毛孢壳科为主的动-植物病原菌生态功能群组。Ⅲ级主要以黑星菌科为主的植物病原菌，晶杯菌科为主的腐生菌和柔膜菌目为主的内生菌功能群。Ⅳ级主要以皮壳菌科、珊瑚菌科、肉座菌目、黑酵母菌、被孢霉科为主的腐生菌，Chaetosphaeriaceae 为主的外生菌和柔膜菌目为主的内生菌功能群。Ⅴ级主要以肉座菌目、黑酵母菌、被孢霉科、古根菌科为主的腐生菌，水盘菌科为主的内生菌和以红菇科为主的外生菌功能群。

图5 科水平上的真菌生态功能群组解析Fig.5 Analysis of fungal ecological function groups at the family level

3 结论与讨论

本研究发现，不同分解等级倒木的理化性质均存在显著差异。含水率从分解开始到分解后期显著降低，这与前人的研究结果一致[15-17]；倒木含水率降低的原因可能是由于分解初期侵入木质部的微生物类群（侵入活立木中的细菌和侵入木质部的微型真菌）分解掉了细胞间和细胞腔内的单宁、酮、胶和填充体，使倒木发生软腐[3]，导致倒木疏松度增加，孔隙度增大，密度变小，从而增大了水分的储藏空间，增加了含水率。倒木全氮的质量分数从分解初期到分解末期逐渐升高，总碳的质量分数从分解初期到分解末期逐渐降低，这与很多的研究结果相类似[18-20]，这可能由于先驱微生物中的细菌固氮作用以及以倒木为栖息地的动物、昆虫产生粪便的原因增加了氮素的输入[21-22]；而导致总碳含量降低的原因可能是由于分解者的呼吸作用和淋溶作用[19]。倒木的碳氮比值从分解初期到分级末期显著降低，这说明倒木中难分解的物质（甲壳质和木质素）含量逐渐减少[3,23]；此外Kielak 等[24]研究认为氮素可能是倒木分解过程中的限制因子，这可能是由于不同的微生物类群对碳、氮的需求不同而产生的差异。

倒木作为微生物栖息地和营养供给的同时也制约着微生物的更新和演替。倒木的分解从简单的化合物开始，一般的规律为糖类的分解、纤维素类并伴随半纤维素的分解、甲壳质和木质素的分解。针叶树种的倒木多发生褐色腐朽，木材褐腐菌多为真菌中的高等担子菌（多孔菌、革菌、齿菌和伞菌类）和少数的子囊菌，主要分解纤维素和半纤维素，但对于木质素的分解能力很弱，仅将木质素的分子脱去甲氧基或将其氧化[3]。本研究中倒木的纤维素含量和半纤维素含量从Ⅰ～Ⅴ级逐渐降低，木质素含量从Ⅰ～Ⅴ级逐渐升高，这与都很多研究结果相类似[16,25]，说明落叶松倒木在分解的过程中纤维素首先进行分解，同时半纤维素也伴随着纤维素进行分解，而将较难分解的木质素留下，这个阶段木材腐朽菌改变了落叶松倒木的颜色。

倒木的分解受众多生物学和非生物学因素的影响，而同时倒木的径级、腐烂程度（分解等级）也能够影响微生物的多样性[8]，为相关真菌占据各自生态位提供生境[26]。本研究中倒木理化性质与微生物组成的冗余分析结果显示，各分解等级倒木上的真菌组成和影响因素各不相同，这表明不同分解等级倒木的结构、组分、基质等的差异能够对真菌的主要类群、相对丰度以及群落的演替产生影响[27-28]。从Alpha 多样性指数上也可以看出，各分解等级倒木真菌的Alpha 多样性指数存在波动，但在Ⅰ级和Ⅱ级并无显著性差异；而随着分解的进行，腐烂程度的加大，分解基质发生了变化，真菌的Alpha 多样性指数出现了不同程度上的显著性差异，这样的结果说明了真菌的物种多度、丰富度、均匀度在倒木分解的各个阶段发生了变化，而这种变化并不是取代性或者颠覆性的，是一个具有连续性的、发展性的演替过程，这与Prewit 等[27]和Schowalter 等[23]的研究相类似。此外，Beta 多样性NMDS 分析的结果显示倒木分解过程所划分的3 个阶段也显示出了相类似的结果。

池玉杰等[3]研究认为，在木材分解的过程中微生物的群落具有一定的演替规律。以山毛榉的分解为例，真菌群落演替的一般规律为：1）先驱阶段，主要由半知菌、子囊菌、镰刀菌等微型真菌组成。2）腐朽初期，主要由草本对策木腐菌组成。3）腐朽期，主要由竞争对策或忍耐对策的木腐菌组成。4）最终阶段，即腐殖化阶段，主要由毛霉、青霉、木霉、镰刀菌等土壤习居菌组成。先驱阶段微型真菌在分解的初期侵入木材的木质部，分解掉细胞间和细胞腔内的单宁、酮、胶和填充体，并使其变色和软化，从微生物种群演替的角度看，池玉杰等认为这些微生物是木材腐朽的先驱类群，属于非腐朽菌类[3,29]；这与本研究中，Ⅰ～Ⅱ级分解等级倒木上的主要真菌生态功能群组（主要起木材变色作用的长喙壳菌科为主）相类似。腐朽期是木材分解的稳定发展阶段，这个阶段木腐菌就积极分解细胞壁的纤维素、半纤维素和木质素，使木材分解或腐朽[3]；这与本研究中Ⅳ～Ⅴ级分解阶段真菌主要生态功能群为腐生菌的研究结果以及Ⅳ～Ⅴ级倒木中相纤维素、半纤维素和木质素含量较低的研究结果相类似。

我们研究发现，Ⅱ级分解等级倒木上毛孢壳科真菌较多，他属于动-植物病原菌的生态功能群，能够在动物和植物之间进行腐生生长，这是否可能来自于土壤动物或昆虫的啃食而携带的真菌类群？此外从分解的整个过程来看，无论是倒木的理化性质，还是各级倒木上的真菌组成和结构都存在较大的波动；这样的研究结果说明参与倒木分解的过程不只包含真菌类群，可能还包括细菌、放线菌以及土壤动物和昆虫[22,30]；因此，倒木的分解还存在很多重要的影响因素，需要进一步研究和分析。