喷嘴型号的选择对流式分选效果的影响

顾 云 张立霞 李淑珂

1 蓬莱区人民医院 山东 蓬莱 265600；2 滨州医学院基础医学院 山东 烟台 264003； 3 滨州医学院烟台附属医院 山东 烟台 264100

流式细胞分选技术是利用流式细胞仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，根据实验需求将目的细胞群分选出来。相对于机械法、免疫磁珠法、单细胞捕获法等传统细胞分离手段，具有分选参数多、分选群体多、分选纯度高、灵活性强等优势[1]，目前越来越多的实验涉及到流式分选，分选颗粒种类也越来越多，有动物细胞、植物细胞[2-5]、微生物[6-8]及人工合成微粒等。要得到一个好的分选结果，在做流式分选的时候，不但要注意分选方案的选择、初始细胞状态、接收管处理等因素[9]，喷嘴的选择也是影响分选结果的一个重要因素。目前常用的喷嘴型号有70、85、100、120等，研究用70，100两种不同型号的喷嘴，观察喷嘴对不同大小的颗粒、不同的荧光染色实验分选的影响。

1 实验试剂、分组与方法

1.1 实验仪器 BDAria III流式细胞仪(BD公司，P64828200134)。

1.2 分选颗粒 BD Calibiite Bead(BD公司，23-3171-07)，Thp-1、H6和人外周血单核细胞(滨州医学院馈赠)。

1.3 实验试剂 人CD41-PE(BD公司，563562)，Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(BD公司，556547)，Drop Delay Bead(BD公司，5271955)。

1.4 实验分组 BD Calibiite Bead组：选取BD Calibiite Bead中的U，Apc和PE三种荧光微球各100 μL加至3 mL磷酸盐缓冲液中。

Thp-1组：计数5×106个Thp-1细胞，放至60℃水中20 min造成细胞损伤，5 μL Annexin V-FITC和5ul PI染色20 min。

H6组：计数5×106个H6细胞，放至60℃水中20 min造成细胞损伤，Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL染色20 min。

人外周血单核细胞组： 全血溶红，淋巴细胞分离液分离出外周血中的单个核细胞，加人CD14-PE 5 μL染色30 min。

1.5 统计学方法 应用SPSS 25.0 统计软件对实验数据进行分析。使用χ2检验分析定性资料，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验步骤

2.1 分选条件 分选条件调节(表1)，分选模式选择纯度模式(Purity)。

表1 70、100喷嘴的分选条件

2.2 四组样本分别进行流式分选 使用70、100两种不同型号的喷嘴，观察上样时液流的稳定性，包括侧液流的连续性、是否出现断流情况、Gap值的变化、正液流的分选点的稳定性。

收集所选门内的颗粒，将收集的颗粒进行流式检测，观察颗粒的位置的变化及检测流式的分选纯度。BD Calibiite Bead组分别收集PE阳性微球和APC阳性微球，Thp-1组收集Annexin V-FITC和PI双阳性细胞，H6组收集Annexin V-FITC和PI双阳性细胞，人外周血单核细胞组收集人CD14-PE阳性细胞。

单核细胞组PI染色，观察单核细胞组分选后的细胞活性。

3 结果

3.1 不同组分别用70、100的喷嘴进行分选时的液流稳定性 分选液流稳定为“+”，出现管路堵塞、液流中断；Gap值变化频繁，上下液滴间移动；正液流中的分选点不稳定为“-” 。

3.2 不同组分别用70、100的喷嘴进行分选情况 与70喷嘴相比，100喷嘴的分选纯度BD Calibiite Bead-PE组差异无统计学意义，Thp-1细胞组、H6细胞组、人单核细胞组分选纯度高，差异有统计学意义(P<0.05)(图1，表2)。

图1 不同组分选后的纯度的变化

表2 不同组分选后的纯度(n=5，%)

3.3 分选后人外周血单核细胞的活性 人外周血单核细胞用70喷嘴和100喷嘴分选后细胞活性都在90%以上，用100喷嘴分选活性较70喷嘴高(图2)。

图2 人外周血单核细胞分选后细胞活性

4 讨论

流式分选效果同流式细胞仪的机型，机器的维护，喷嘴的选择，分选条件的选择均有关系[10-12]。使用流式细胞仪进行分选时，细胞大小不超过喷嘴孔径的五分之一，绝不超过三分之一。所以我们在进行细胞分选时就要有所选择，像直径较小的细胞或人工合成微粒，荧光抗体结合较稳定的实验可以选择小孔径的喷嘴，因为小孔径的喷嘴分选速度更快，分选纯度也很好。对于干细胞、神经元、粒细胞这些脆弱或易激惹的细胞，要选用对细胞损伤相对较小的大孔径的喷嘴。

细胞凋亡染色后分选，分选纯度均不高，荧光素FITC、PI的平均荧光强度均有所降低，考虑在分选过程中，特别是打入接收管的过程中造成了结合在细胞表面的抗体脱落，像这种结合较不稳定的实验要进行分选时最好选用大孔径喷嘴，最低速度分选。

在合理使用喷嘴的同时做好喷嘴的护理。喷嘴在使用前和使用后均要置于纯水中进行常规的超声，以防止鞘液或分选颗粒黏贴至喷嘴“o”圈的内侧造成液流不稳。但超声时间尽量不要超过30 min钟，超声后放置于喷嘴架上晾干，不要长时间超声或放置于纯水中，否则容易造成喷嘴上“o”圈的脱落。如果“o”圈脱落，可以购置单独的“o”圈，在每次分选前用扁头棉签沾水将其放置在喷嘴原位置使用。