hPMSCs对白血病细胞Jurkat T表面CD分子表达的影响及机制研究

丁瑞松 胡 雯 黄盼盼 胡 涛

滨州医学院免疫学教研室 山东 烟台 264003

间充质干细胞细胞(mesenchymal stromal cells，MSCs)可从骨髓、脐带、脂肪、牙龈、胎盘和其他组织中分离和扩增[1]，具有自我更新和多向分化潜能。人胎盘源MSCs(human placenta derived mesenchymal stromal cells, hPMSCs)源于足月胎盘组织，是经人工培养扩增的、未分化的间充质样细胞。这些细胞既具有MSC的特征，也具有与胎盘来源相关的独特表型[2-4]。根据培养条件不同可定向分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞[5]。MSCs具有很高的生长可塑性，可用于组织再生和造血干细胞移植[6-7]及一系列急慢性疾病治疗[5,8-9],诸如类风湿性关节炎、皮肤创伤和肝病[10-13]。

在适应性免疫应答中，抗原提呈细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞之间的相互作用，影响免疫记忆的产生和宿主的免疫稳态[14]。MSCs可通过多种方式调控T、B淋巴细胞的激活及功能参与调节[15]。其中，骨髓来源的MSCs可以通过分泌TGF-β、IFN-γ、IL-6、IL-10或表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)来促进T细胞向Treg方向分化[16-17]。hPMSCs能通过抑制T细胞增殖、诱导CD8+T细胞凋亡，改善与治疗GVHD[18]；也可通过上调外周血中的Treg细胞、促进成纤维细胞样的滑膜细胞、脾细胞增殖、改善细胞因子分泌模式调节小鼠关节炎[19-20]。就T细胞而言，其成熟、分化及针对丝裂原的刺激反应均伴随糖基转移酶、糖苷酶及相应产物的改变[21]。T细胞自身O-糖基化的动态变化既可调控不同阶段T细胞的发育，又可影响T细胞归巢的信号通路。O-糖基化的关键酶(T-synthase，T-合酶)活性也可调控胸腺细胞的成熟过程。由于T-合酶活性受控于其特定的分子伴侣(core 1 β3-Gal-T-specific molecular chaperone，Cosmc)，所以Cosmc缺失会导致外周淋巴系统中T细胞大量丢失[22]。为研究O-糖基化的变化过程，研究者将人类淋巴细胞白血病细胞株Jurkat T细胞，作为理想模型[23]。该细胞Cosmc基因突变导致O-糖基化异常，仅表达O-糖基化的中间产物Tn抗原(galNAC-α-O-Ser/Thr，CD175)。Tn抗原可以在T-合酶的作用下，进一步连接半乳糖(gal)、N-乙酰葡萄糖胺(glcNAC)形成更为复杂的O-糖链结构。这些复杂的结构与细胞的生物学行为密切相关。随着新型细胞O-糖组检测技术(Cellular O-glycome Reporter/Amplifition，CORA)[23]的开发应用，研究者可以更容易、更准确地分析O-糖组的变化，O-糖基化在肿瘤发生发展及免疫细胞表型改变中的作用也成为一个新的研究热点。

基于此，本研究将hPMSCs与 Jurkat T细胞共培养，采用FCM检测共培养前后Jurkat T表面标记分子CD4、CD28、CD175的表达水平；Western blot检测Cosmc蛋白，荧光法检测T-合酶活性，CORA检测O-糖组变化，探究hPMSCs对Jurkat T表面CD分子表达的影响及机制，以期为hPMSCs用于人类淋巴细胞白血病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；流式细胞仪(Cytoflex，美国Beckman Coulter公司)；SDS-PAGE电泳仪(美国Bio-Rad公司)；化学发光成像系统(英国Chenis Cop公司)；Moldi-TOF质谱仪(美国Agilent Technologies公司)。

1.1.2 药品与试剂 小鼠抗人Tn抗原单克隆抗体(anti-CD175，美国埃默里大学巨同忠博士惠赠)；羊抗鼠IgM-APC(美国Santa Cruze公司)；CD73-FITC、CD44-FITC、CD90-FITC、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE(美国Invitrogen公司)；CD4-PE、CD28-PerCP(美国Biolegend公司)。小鼠抗人单克隆抗体(anti-Cosmc，anti-α-Tubulin)(美国Proteintech Group公司)。

1.1.3 hPMSCs 由本室从健康剖宫产产妇胎盘分离；人白血病细胞株Jurkat T(Clone E6-1，CL-0129)购于中国武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 hPMSCs的分离、培养 经青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院伦理学委员会批准，产妇知情同意后，无菌采集其足月剖宫产后胎盘。胎盘离体后立即低温储存送往实验室，用含1%双抗D-Hanks液冲洗胎盘组织，剪去胎盘的蜕膜组织后剪碎；Ⅳ型胶原蛋白酶消化。参考相关文献[24]稍加改良，于6小时内分离出hPMSCs接种到6孔板中(细胞的密度1×108/孔)，37℃培养20天左右进行第一次细胞传代(期间，每隔4天进行半量换液，经3次半量换液后进行首次全量换液)；培养3～5代的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞共培养 将2×106hPMSCs接种后培养12 h，加入1×106Jurkat T细胞，DMEM(10%胎牛血清，100 μmol/L青霉素、链霉素)培养48 h，分别收集Jurkat T及hpMSCs细胞用于后续实验。

1.2.3 hPMSCs成脂、成骨分化鉴定 将培养至第3代的hPMSCs接种于12孔板(5×104/孔)，细胞生长密度达85%～90%后，对hPMSCs进行成脂、成骨诱导分化鉴定。每孔用1.5mL完整的MesenCultTM成脂分化培养基替换原有培养基。每3天更换一次培养基，培养至15天弃掉培养基，通过油红O染色观察hPMSCs成脂分化情况。成骨分化方法同成脂分化，采用MesenCultTM成骨分化培养基培养细胞15天后，茜素红S染色观察分化情况。

1.2.4 hPMSCs表型鉴定 hPMSCs培养至第5代，收集细胞，加入荧光抗体(鼠抗人FITC-IgG1、PE-IgG2b、FITC-CD73、FITC-CD90、FITC-CD44、PE-CD34、PE-CD45、PE-HLA-DR)，4℃避光孵育30 min；4℃离心(1 000 r/min，5 min)，洗去未结合抗体。PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

1.2.5 细胞表面CD4、CD28、CD175分子的检测 分别收集共培养前后的hPMSCs及Jurkat T细胞，分别加入CD4-PE、CD28-PerCP、CD175-APC，4℃避光孵育30 min；离心洗去未结合的抗体。400 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。

1.2.6 胞浆蛋白提取 收集共培养前后的Jurkat T细胞于干净预冷的1.5 mL EP管中，加入预冷的细胞质提取试剂I 200 μL(CERⅠ 198 μL+蛋白酶抑制剂2 μL)，涡旋振荡15 s，冰上孵育10 min；再加入预冷的裂解液CERⅡ 11 μL，涡旋振荡5s，充分混匀后于冰上孵育1 min。16 000 g，5 min，4℃离心，收集上清(胞浆蛋白，定量)至预冷的1.5 mL EP管中，-80℃保存备用。

1.2.7 总蛋白提取 收集共培养前后的Jurkat T细胞于干净预冷的1.5 mL EP管中，向每管细胞中加入预冷的150 μL裂解液(RIPA∶PFSM=100∶1)后涡旋15 s，冰上孵育30 min。16 000 g，5 min，4℃离心，收集上清至预冷的EP管中，蛋白定量后置-80℃保存备用。

1.2.8 T-合酶活性测定 UDP-Gal作为供体，GalNAc-α-(4-MU)为受体，采用荧光法检测T-合酶的活性[48]。50 μL反应体系(成分见表1)，混匀后加入到96孔黑板中， 37℃孵育60 min。取出96孔黑板，每孔中加入100 μL NaOH-Gly溶液终止反应，用酶标仪检测样品在Ex=355 nm，Em=460 nm处的荧光强度，根据标准曲线计算出每个样品的T-synthase活性。

表1 反应体系成分

1.2.9 Western blot 将蛋白上清与6×蛋白上样缓冲液按照5∶1体积比加入到EP管中，混匀后置于金属浴中，95℃，10 min。20 μg蛋白经PAGE电泳转移至再将PVDF膜，加入相应的一抗(α-Tubulin为1∶10 000，Cosmc为1∶500)于4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下摇床孵育120min。洗涤4次，加入发光液；化学发光成像系统曝光、拍照。

1.2.10 质谱检测细胞O-糖组结构 细胞共培养至48 h后弃去原培养基，加入4 μL 50 μM Bn-α-GalNAc，对照组每孔加入4 μL DMSO，培养3天；按文献表述方法收集细胞培养上清[48]，经C18 Sep-Pak柱吸附、洗脱获取O-聚糖，质谱仪分析O-糖链结构。

1.3 统计学方法 所有实验重复3次，采用SPSS 23.0软件和GraphPad Prism 8进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 hPMSCs的表型鉴定及诱导分化 原代hPMSCs传代培养至第3代后，细胞呈长梭形，漩涡状生长(图1A)。在诱导成脂及成骨细胞分化的培养基中培养15天后，成脂分化的hPMSCs中可见鲜红色脂滴(图1B)，成骨分化的hPMSCs中可见红色钙化小结(图1C)。hPMSCs传代培养至第5代，经流式细胞术鉴定免疫表型，结果显示，hPMSCs高表达CD73、CD90和CD44，几乎不表达CD45、CD34及HLA-DR(图1D)；具有典型的MSCs特征。

A.第3代hPMSCs形态(100×);B.油红O染色示hPMSCs成脂分化(400×);C.茜素红染色示hPMSCs成骨分化(400×);D.流式细胞仪示hPMSCs表面免疫表型。

2.2 hPMSCs对Jurkat T细胞表面CD分子表达的影响 Jurkat T细胞表面低表达CD4分子(平均荧光强度为2 136.3±121.8)，高表达CD28和CD175分子(平均荧光强度分别为56 858.8±720.1，78 325.7±140.9)。与hPMSCs共培养后Jurkat T细胞表面CD4分子表达升高(平均荧光强度为4 151.2±213.4)，CD28和CD175分子表达降低(平均荧光强度分别为34 895.2±410.4，21 790.6±718.1)。见图2。

A,B.hPMSCs上调Jurkat T细胞表面CD4分子的表达；C,D.hPMSCs下调Jurkat T细胞表面CD28分子的表达；.E,F.hPMSCs下调Jurkat T细胞表面CD175分子的表达，***P<0.001。

2.3 hPMSCs升高Jurkat T细胞T-合酶活性及Cosmc蛋白 前期研究发现Cosmc突变导致Tn抗原(CD175)表达。本研究显示，共培养后Jurkat T细胞T-合酶活性增高(图3A)；Western blot显示Cosmc蛋白表达升高(图3B)。提示hPMSCs可通过改变Cosmc蛋白水平，影响T-合酶活性。

A.与hPMSCs共培养前后Jurkat T细胞T-合酶活性变化；B.与hPMSCs共培养前后Jurkat T细胞Cosmc的蛋白表达情况。***P<0.001。

2.4 hPMSCs改变Jurkat T细胞O-糖组结构 O糖基化异常导致Tn抗原(CD175)表达；hPMSCs可抑制Jurkat T细胞表面CD175分子的表达。CORA结果显示，hPMSCs表达核心1和核心2来源的O-聚糖结构，核心1 O-聚糖结构(m/z：955.4、1 129.5、1 316.6)；核心2 O-聚糖结构(m/z：1 217.6、1 648.7、1 782.8、1 939.9、2 058.0、2 563.2)(图4A)。Jurkat T组细胞无核心1及核心2来源的O-聚糖结构，但与hPMSCs共培养后出现核心1来源的 O-聚糖结构(m/z：955.4、1 316.6)(图4B)。

A.hPMSCs中核心1和核心2来源的O-聚糖；B.共培养前后Jurkat T细胞O-聚糖结构。

3 讨论

O-糖基化是最常见的蛋白质翻译后加工修饰的形式之一。在白细胞表面已鉴定出的200多种不同蛋白质中，几乎所有蛋白质都会经过糖基化修饰。大多数糖蛋白以特征性的糖基化模式在每个糖基化位点、以聚糖异质群体的形式出现。T细胞参与抗原识别以及在随后的细胞信号转导过程多以受体配体相互结合发挥作用；而大多数受体是糖蛋白[26]。Cosmc作为T-合酶的分子伴侣促使T-合酶正确盘曲折叠，发挥正常的生物活性；具有正常生物学活性的T-合酶将UDP-Gal上的半乳糖连接到CD175分子(Tn抗原)上形成核心1结构(Galβ1,3GalNAc-α-O-Ser/Thr)的O-聚糖，才能使糖链进一步的正确延伸[25]；结构复杂的O-糖链在免疫调节发挥重要作用。

研究认为，MSCs具有明显的抗炎和免疫调节特性；在多系分化[27]、免疫抑制[28]、抗纤维化[28]、抗凋亡[29]等方面也具有极其重要的作用。因此，研究人员试图证明基于胎盘来源间充质干细胞的细胞疗法对各种疾病具有适度的疗效[30-32]。在T细胞介导的免疫反应的几个关键步骤中，MSCs可以对T细胞发挥抑制作用，包括T细胞亚群的存活、激活和分化；并可通过多种方式诱导T细胞凋亡。例如，骨髓间充质干细胞可以通过依赖于FasL的凋亡途径诱导自身反应性T细胞凋亡[33]。与静息的T细胞相比，活化的T细胞对MSC诱导的凋亡更敏感。这可以归因于促炎因子刺激的MSCs中高水平的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达所催化的色氨酸耗竭和色氨酸代谢物的产生[33]。在小鼠MSCs中也观察到了类似的T细胞活性抑制[34]。然而，这些研究并未涉及幼稚的白血病细胞Jurkat T表面CD分子的变化是否受hPMSCs的影响。本研究发现，hPMSCs能够对Jurkat T细胞表面CD分子的表达产生一定的影响，与hPMSCs共培养后的Jurkat T细胞表面CD4分子表达降低，CD28和CD175分子表达降低(图2)。由于B7/CD28结合是T细胞活化的重要信号，促进抗凋亡蛋白BCL-2的表达，有助于T细胞的活化、增殖分化，所以Jurkat T细胞表面CD28的下调，提示hPMSCs可抑制Jurkat T细胞增殖。再者，CD4表达水平的增高，可以预示T细胞的进一步成熟。

值得注意的是，CD175被视为多种肿瘤细胞的标志物，其表达水平与肿瘤预后密切相关；Jurkat T细胞表面高表达CD175亦决定了其恶性特征。与hPMSCs共培养后，Jurkat T细胞表面CD175表达受抑，并出现共培养前Jurkat T细胞不具有的O-糖基化结构，核质比为955.4(gal-galNAC)和1 316.6(Sialy-gal-galNAC)的核心1来源的O-聚糖；提示hPMSCs可促进Jurkat T细胞O-糖链的延伸，进而影响Jurkat T细胞的恶性行为。

hPMSCs具有复杂的O-聚糖结构，表达核心1(m/z：955.4、1 129.5、1 316.6)和核心2(m/z：1 217.6、1 648.7、1 782.8、1 939.9、2 058.0、2 563.2)来源的O-聚糖结构。与hPMSCs共培养后，Jurkat T细胞表面CD4、CD28及CD175变化应与其O-糖基化程度有关；Jurkat T细胞的核心1衍生型O-聚糖结构与hPMSCs上的部分糖结构相一致(图4.A)可归因于Cosmc及T-合酶活性的升高。因此，有理由推测，共培养后，Jurkat T细胞中的Cosmc可能来源于hPMSCs的外泌体或者分泌的囊泡，Cosmc蛋白促进了T-合酶活性的增高。这种推测或许需要后续研究进一步证实。

综上，本研究首次发现hPMSCs对白血病细胞Jurkat T表面CD分子的调节受控于O-糖基化。hPMSCs可通过上调Cosmc蛋白、T-合酶活性改变Jurkat T细胞O-糖基化状态影响其表面CD4、CD28及CD175表达。