免疫抑制受体igsf 9基因敲除鼠的构建以及对肿瘤生长的影响

孙 爽 刘祎璠 李尊岭

滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山东省肿瘤免疫治疗研究创新团队 山东 烟台 264003

免疫受体酪氨酸抑制基因序列(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)是由6个保守的氨基酸序列组成(I/L/V-x-x-Y-x-L/V)，其中酪氨酸(Y)残基的磷酸化可以聚集下游的磷酸酶SHP-1、SHP-2或者SHIP-1，进而调控免疫细胞的活性。由于磷酸酶以抑制免疫细胞活性为主，因此含有ITIM的膜受体统称为免疫抑制受体[1]。迄今为止，从人类蛋白组中鉴定出109个膜蛋白细胞内区域含有的ITIM基序[2]。

免疫球蛋白超家族成员9(immunoglobulin superfamily member 9，IGSF9)是2002年从小鼠胚胎中克隆出的一个新基因，包含5个Ig结构域、2个FnIII(III型纤连蛋白)结构域、跨膜区和胞内尾巴，其中细胞内908～913位点上的氨基酸残基是经典的ITIM，因此IGSF9被列为免疫抑制受体家族成员[3-4]。在哺乳动物的胚胎发育时期，IGSF9主要表达在中枢神经系统的背根神经节、嗅觉上皮、三叉神经节和后脑神经上皮，主要功能与神经系统的运动以及抑制性神经递质的传递有关[4]。IGSF9在子宫内膜癌中的表达是毗邻正常组织的6倍以上，而且IGSF9表达越高，肿瘤肌层浸润越明显，患者预后越差[5-6]。缺氧诱导IGSF9的表达，降低igsf9基因表达后，鼻咽癌的生物学行为受到明显抑制[7]。IGSF9除与神经系统的发育有关外，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，但是IGSF9作为免疫抑制受体是否促进肿瘤的免疫逃避未见报道。

本研究应用CRISPR/Cas9技术，成功构建了igsf9基因敲除鼠，皮下接种Lewis肺癌细胞(LL/2)，绘制肿瘤生长曲线、流式细胞仪分析肿瘤组织中各免疫细胞的水平，初步探究IGSF9促进肿瘤免疫逃避的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Lewis肺癌LL/2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司(STR鉴定正确)。C57BL/6小鼠购自上海南方模式生物科技有限公司，饲养于滨州医学院SPF级动物房，本项目所涉及动物实验均获滨州医学院动物医学伦理委员会批准(No.2018-19)。Anti-mouse CD3-FITC，Anti-mouse CD4-APC，Anti-mouse CD8-APC，Anti-mouse CD45-FITC，Anti-mouse-CD45-PE，Anti-mouse CD45-APC，Anti-mouse Ly6G-FITC， Anti-mouse Ly6C-APC，Anti-mouse F4/80-APC，Anti-mouse CD19-APC，Anti-mouse CD25-PE购自Biolegend公司。细胞计数器与细胞计数板购自美国伯乐公司，异氟烷购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，细胞培养基购自Sigma-Aldrich公司，小鼠基因型快速鉴定试剂盒购自Transgene公司。

1.2 仪器 C6-Plus流式细胞仪购自BD公司，HR40-IIA2生物安全柜购自海尔公司，小型高速冷冻离心机购自Eppendorf公司，显微镜购自日本Olympus公司，HERAcell培养箱购自美国ThermoFisher公司，PCR仪购自Bio-Rad公司。

1.3igsf9基因敲除小鼠的构建

1.3.1 设计特异靶向RNA 设计igsf9的向导RNA(sgRNA)以及体外合成Cas9 mRNA应用CRISPR/Cas9网址，设计靶向igsf9外显子4-9的特异sgRNA应用网址(https://zlab.bio/guide-design-resources)。序列如下：sgRNA1: GTCACACTGGTCATTCCCAG；sgRNA2: CCTAGGCTATTCTCAACCTC；sgRNA3: TTTAATTCAGCGCTGTGGTT；sgRNA4: GTTTAATTCAGCGCTGTGGT。igsf9基因敲除小鼠构建策略见图1。通过体外转录的方式获取Cas9 mRNA。显微注射将Cas9 mRNA和igsf9-sgRNA注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性F0代小鼠，然后与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代小鼠，F1代小鼠自交，获得野生型以及敲除的纯合子小鼠，野生型小鼠命名为C57BL/6-igsf9+/+，杂合子小鼠命名为C57BL/6-igsf9+/-，敲除的纯合子小鼠命名为C57BL/6-igsf9-/-。

图1 igsf 9基因敲除小鼠构建策略

1.3.2igsf9基因敲除小鼠的鉴定 根据sgRNA的敲除位点，本研究设计特异引物，应用PCR扩增目的条带，小鼠基因型鉴定策略见图2。引物序列如下：P1，CTCGAACGGTCCGGGAAATACAGA；P2，CAACACCACCGCCAGCCAAAAT；P3，GCTGCCTGCCTGGGTTGGACT；P4，GTGAGGGAGGGCAGAGGTAAGAAG。PCR反应体系如下：Lysate 4 μL，正向引物(10 μM)0.5 μL，反向引物(10 μM)0.5 μL，2×TransDirect Mouse Genotyping superMix 10 μL，纯净水 5 μL，总体积为 20 μL。PCR反应条件如下：94℃ 10 min，94℃30 s，55℃ 45 s，65℃1 min，重复 30 周期，65℃10 min。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表引物P1、P2、P3和P4的位置。

1.4 小鼠皮下成瘤实验 将2×106个LL/2细胞接种到6周龄C57BL/6小鼠皮下，实验分C57BL/6-igsf9+/+(n=3)、C57BL/6-igsf9-/-2组(n=5)。每3天测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。当肿瘤体积大于2 cm3时，麻醉状态下处死小鼠，剥离肿瘤组织，制备单细胞悬液。

1.5 流式细胞仪分析各免疫细胞水平 将上述单细胞悬液进行染色，各免疫细胞标志抗体如下：CD3+T细胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC)，CD4+T细胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC、鼠抗CD4-APC)，CD8+T细胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗CD3-FITC、鼠抗CD8-APC)，中性粒细胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗Ly6G-FITC、 鼠抗Ly6C-APC)，巨噬细胞(鼠抗CD45-PE、鼠抗Ly6G-FITC、鼠抗F4/80-APC)以及B细胞(鼠抗 CD45-FITC、鼠抗CD19-APC)。

1.6 统计学方法 应用Prism 7.0软件进行统计学分析。定量资料以(±s)表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C57BL/6-igsf9+/+与C57BL/6-igsf9-/-小鼠的基因型鉴定 根据1.3.2小鼠基因型鉴定策略，以C57BL/6-igsf9+/+鼠尾作为模板，引物P3、P4能够扩增出832 bp片段；以C57BL/6-igsf9+/-鼠尾作为模板，引物P1、P2能够扩增出753 bp片段，引物P3、P4能够扩增出832 bp片段；以C57BL/6-igsf9-/-鼠尾作为模板，引物P1、P2能够扩增出753 bp片段，引物P3、P4不能扩增出片段。本研究对C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠进行基因型鉴定，结果见图3。PCR结果显示：在C57BL/6-igsf9+/+小鼠体内，引物P1、P2没有扩增出条带(泳道1、3、5)，引物P3、P4扩增出832 bp DNA片段(泳道2、4、6)；在C57BL/6-igsf9-/-小鼠体内，引物P1、P2扩增出753 bp条带(泳道7、9、11、13、15)，P3、P4没有扩增出DNA片段(泳道8、10、12、14、16)。

M为DNA ladder，1、3、5、7、9、11、13、15泳道代表P1和P2引物扩增的DNA片段(753 bp)；2、4、6、8、10、12、14、16代表引物P3和P4扩增的DNA片段(832 bp)。

为进一步明确C57BL/6-igsf9-/-小鼠体内敲除效果，本研究提取小鼠基因组DNA进行测序，序列比对见图4。与C57BL/6-igsf9+/+测序结果相比较，C57BL/6-igsf9-/-DNA序列从1 321到4 209位点，出现明显的缺失，缺失序列位于exon4-exon9之间，进一步表明本研究成功构建了igsf9基因敲除小鼠模型。

Query为野生型基因组序列；Subject为实际测序结果。

2.2 敲除igsf9基因后小鼠免疫细胞水平的变化 敲除igsf9基因后，与C57BL/6-igsf9+/+相比，C57BL/6-igsf9-/-小鼠的体质量无明显变化(图5 A)，CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞以及巨噬细胞在外周血、脾脏以及骨髓中的比例无明显改变(图5 B、C、D)，表明敲除igsf9基因不影响小鼠的体质量以及各免疫细胞的水平。

在C57BL/6小鼠体内敲除igsf 9基因表达后，检测小鼠的体质量(A)、外周血(B)、脾脏(C)以及骨髓中(D)各免疫细胞的水平。PB 代表外周血，SP代表脾脏，BM 代表骨髓。

2.3 C57BL/6-igsf9-/-小鼠对肿瘤生长的影响 将LL/2细胞皮下接种到C57BL/6-igsf9+/+和C57BL/6-igsf9-/-小鼠体内，从第5天开始测量肿瘤大小，然后每3天测量1次。肿瘤生长曲线、肿瘤大小和质量结果表明：与C57BL/6-igsf9+/+小鼠相比，C57BL/6-igsf9-/-小鼠体内肿瘤生长明显受到抑制(图6)。

A. 肿瘤生长曲线；B. 当肿瘤超过2 cm3时，处死小鼠后剥离肿瘤组织；C. 称重肿瘤组织，***P<0.001。

2.4 C57BL/6-igsf9-/-小鼠肿瘤组织中CD3+T细胞水平的变化igsf9属于免疫抑制受体家族成员，在小鼠体内敲除igsf9基因的表达，有可能激活小鼠免疫系统进而抑制肿瘤的生长。流式细胞仪检测各免疫细胞在肿瘤组织中的水平，结果显示：C57BL/6-igsf9-/-小鼠肿瘤组织中的CD3+T细胞、CD3+/CD4+T细胞以及CD3+/CD8+T细胞水平均显著高于C57BL/6-igsf9+/+小鼠肿瘤组织相应细胞的水平，P<0.05(图7 A、B、C)；在两组小鼠肿瘤组织中，B细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞水平差异均无统计学意义(图7 D、E、F)。这表明，小鼠体内敲除igsf9基因表达能够促进更多的CD3+T细胞浸润到肿瘤组织，或者促进肿瘤组织中CD3+T细胞的增殖，进而抑制肿瘤细胞的生长。

A. CD3+ T细胞；B. CD3+/CD4+ T细胞；C. CD3+/CD8+ T细胞；D. B细胞；E. 中性粒细胞；F. 巨噬细胞。*P<0.05。

3 讨论

以PD-1/PD-L1为靶点的肿瘤免疫治疗药物在临床上取得了巨大的成功，让肿瘤患者看到了治愈的希望[8]。目前我国FDA已经批准了PD-1/PD-L1单克隆抗体治疗肺癌、黑色素瘤、尿路上皮癌、头颈部鳞癌、结肠癌、淋巴癌、肾癌等肿瘤，但是患者受益率从5%到40%不等，约20%的患者能够从中受益[9]，意味着80%的肿瘤患者有自己独特的免疫逃避方式，探讨和发现新的肿瘤免疫逃避机制，是科研工作者和临床医生面临的重大挑战。

IGSF9是进化上高度保守的蛋白，生物信息学分析表明IGSF9与神经细胞黏附分子(nerve cell adhesion molecules，NCAM)结构相似，都有5个免疫球蛋白结构域、2个III型纤连蛋白结构域、跨膜区以及胞内序列。IGSF9主要表达在胚胎发育时期，在人类发育的第8周到第14周、小鼠胚胎发育的第7.5天到16.5天，能够检测到IGSF9的表达，在成年人正常组织中，没有检测到IGSF9基因的表达。由于IGSF9主要表达在胚胎发育时期的神经系统，因此，IGSF9在突触的形成和传递中的作用报道较多[10]。IGSF9在子宫内膜癌和鼻咽癌中表达水平较高，与病人的预后密切相关[7-8]。

本研究前期查询了TCGA以及The human protein atlas数据库，发现IGSF9在大多数肿瘤组织中都有表达，但是IGSF9在肿瘤发生中的作用未见报道。IGSF9细胞内有经典的ITIM基序，属于免疫抑制受体超家族成员，其是否通过抑制免疫系统促进肿瘤免疫逃避未见报道。本研究首先设计靶向igsf9的特异向导RNA(sgRNA)，利用CRISPR/Cas9技术，向小鼠受精卵中注射igsf9-sgRNA以及Cas9 mRNA, PCR以及测序结果显示：在C57BL/6小鼠体内成功敲除了igsf9基因的表达，构建了igsf9敲除小鼠。接下来，本研究利用igsf9野生型和基因敲除鼠，皮下注射LL/2细胞，构建小鼠皮下成瘤模型。肿瘤生长曲线和肿瘤质量表明：在小鼠体内敲除igsf9基因的表达，能够显著抑制肿瘤的生长。由于IGSF9属于免疫抑制受体家族成员，因此本研究分析了肿瘤组织中各免疫细胞的水平，发现浸润到肿瘤组织中的CD3+T细胞、CD3+/CD4+T细胞、CD3+/CD8+T细胞水平显著升高，而B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞水平没有变化。CD3+T细胞是肿瘤免疫中最重要的细胞，也是杀伤肿瘤的主要细胞。本研究表明：敲除igsf9基因表达后，一方面有可能是促进了更多CD3+T细胞浸润到肿瘤组织；还有可能是早期浸润到肿瘤组织中的CD3+T细胞被激活、扩增。基于以上分析，本研究后期将深入探讨IGSF9与CD3+T细胞之间的相互关系，并阐明相应的机制。

本研究有望发现一个新的肿瘤免疫治疗靶点，为肿瘤免疫治疗药物的研发提供实验依据。