黄花酵素发酵工艺优化

张江宁，杨春，南晓洁，郭尚

山西农业大学山西功能食品研究院（太原 030031）

黄花菜被列为“四大素山珍”之一，色泽金黄，香味浓郁，味道鲜美，营养价值高，富含糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸，具有平肝养血、消肿利尿、抗菌消炎、止血、镇痛、通乳、健胃和安神的功能。研究发现鲜黄花菜经冷冻干燥，其总黄酮、总氨基酸、总糖含量明显高于自然干制黄花菜，冷冻干燥工艺能最大限度地保留黄花菜营养成分，并且实现及时加工。但是目前对于冷冻干燥黄花菜相关产品的开发较少。此次试验以冷冻干燥黄花菜为发酵主原料，在发酵液中适当添加碳源，选用经驯化的乳酸菌作为发酵菌种，对乳酸菌发酵黄花菜的工艺进行优化，为黄花菜的利用提供一种新的思路，这不仅能够最大化利用黄花菜这种优质资源，还能促进黄花菜产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻干燥黄花菜，大同冰华食品有限公司；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），菌种由实验室提供。氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、浓盐酸、福林酚、没食子酸、甲基红、葡萄糖、次甲基蓝、亚铁氰化钾，市售。

1.2 仪器与设备

电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；721型分光光度计（上海光学仪器厂）；发酵罐（赛多利斯集团）；恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；电热鼓风恒温干燥器（上海森信实验仪器有限公司）；水浴锅（金坛市亿能实验仪器厂）；离心机（上海继谱电子科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 发酵黄花菜酵素的制备流程

1.3.2 操作要点

将冷冻干燥黄花菜粉碎，按照一定料液比加入水，煮沸并保持3 min。冷却至40 ℃后，接种菌种，于室温条件避光发酵一定时间后，置于离心管中，在8000 r/min条件下离心10 min，弃沉淀物，将得到的上清液置于-20 ℃保存，待测。

1.3.3 测定指标与测定方法

1.3.3.1 总糖测定

总糖参照GB/T 10782—2006《食品中总糖的测定》的方法测定。

1.3.3.2 总酸测定

总酸参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》的方法测定，测定结果以乳酸质量浓度（g/100 mL）计。

1.3.3.3 总酚测定

参照蒋增良等[1]的方法，采用福林酚法检测总酚。

1.3.3.4 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6.1软件及SPSS 24.0软件进行数据处理及分析。

1.3.4 单因素试验

以黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚质量分数为评价指标，考察糖添加量、菌种接种量、料液比、发酵温度、发酵时间5个因素对产品品质的影响，并确定各因素的最佳值。单因素试验采用的固定参数为冷冻干燥黄花菜20 g、料液比6%、蔗糖添加量3%、接种量0.5%、发酵温度37 ℃、发酵时间6 d。固定其他因素，变化一个因素进行优化，因素变化范围为料液比（2%～8%）、蔗糖添加量（1%～7%）、接种量（0.1%～0.7%）、发酵温度（31～40 ℃）、发酵时间（0～8 d）。

1.3.5 响应面试验设计

参数运用二次正交旋转组合设计进行优化，以影响产品质量主要参数作为输入变量，评估产品质量指标作为输出变量。根据单因素试验结果，将接种量、发酵温度、发酵时间作为试验因素。为更全面地考察因素对结果的影响，将总酸、总多酚作为响应值，进行三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验，优化生产工艺，每个组合重复试验3次，试验因素水平编码见表2。

表1 试验因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 糖添加量对黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚的影响

以糖类物质作为微生物发酵过程中的主要碳源，通过总糖质量分数变化分析微生物生长和代谢状况[2]。总酸也是衡量发酵成熟度的主要指标，同时也是反映其质量品质的重要理化指标[3]，糖添加量对黄花菜发酵总糖、总酸、总多酚影响的结果如图1和图2所示。当糖添加量小于3%时，总糖质量分数不断降低，总酸质量分数升高，多酚质量浓度增加。当糖添加量大于3%时，总糖质量分数不断增加，总酸质量分数虽有波动但区别不大，多酚质量浓度降低。总糖、总酸质量分数代表发酵进行的程度，总糖质量分数越低，总酸质量分数越高，发酵越彻底，同时原料利用率越高。综合考虑，最终糖添加量选用3%。

图1 糖添加量对总糖、总酸质量分数的影响

图2 糖添加量对总多酚质量浓度的影响

2.1.2 菌种接种量对黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚的影响

由图3可知：随着接种量增加，总酸质量分数不断升高，总糖质量分数不断降低，说明菌种的加入有效促进发酵反应。当接种量小于0.3%时，总糖质量分数下降不明显。当接种量大于0.3%时，总糖质量分数明显下降，这说明接种量太低导致菌体在发酵过程中生长较慢，故代谢少，而大的接种量有利于缩短菌体生长的调整期，加速总糖降解。由图4可知：当接种量为0.5%时，总多酚质量浓度最高，这是由于乳酸菌产生的酶类及有机酸使黄花菜中酚类物质溶出并呈游离态，导致发酵过程中总酚质量浓度上升；当接种量为0.7%时，总多酚质量浓度又有所下降，这可能是由优势菌种为维持自身生长产生降解酚类的物质造成的。为使总糖较低、多酚较高，接种量选择0.5%。

图3 接种量对总糖、总酸质量分数的影响

图4 接种量对总多酚质量浓度的影响

2.1.3 料液比对黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚的影响

由图5可知：随着料液比增加，总糖质量分数逐渐增大，之后趋于稳定，总酸质量分数逐渐增大，说明发酵过程中的发酵速度与发酵用原料浓度密切相关。料液比过低，物料中有效溶出物过低，因此总糖、总酸处于较低水平，随着料液比增加，溶出物增加，发酵产物增多，发酵彻底。由图6可知：当料液比为6%时，总多酚质量浓度趋于稳定；物料继续增多，总多酚质量浓度并未明显增加，这是由于物料浓度过高不利于菌种的生长以及总多酚溶出。综合考虑，料液比选择6%。

图5 料液比对总糖、总酸质量分数的影响

图6 料液比对总多酚质量浓度的影响

2.1.4 发酵温度对黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚质量分数的影响

由图7可知：当温度低于37 ℃时，随着发酵温度升高，总糖质量分数逐渐降低，之后趋于稳定，总酸质量分数逐渐增大，说明发酵温度过低直接影响菌丝生长、影响总糖的降解与总酸生成；当发酵温度为37℃时，总糖质量分数最低，总酸质量分数最大，说明发酵彻底，原料利用率高。由图8可知：温度变化对总多酚质量浓度的影响不大，说明该温度变化范围不足以对多酚的累计构成影响。综合考虑，发酵温度选择37 ℃。

图7 发酵温度对总糖、总酸质量分数的影响

图8 发酵温度对总多酚质量浓度的影响

2.1.5 发酵时间对黄花菜酵素总糖、总酸、总多酚质量分数的影响

从图9和图10可以看出：前2 d总糖质量分数增加，这可能是发酵前期总糖在高渗透压下从黄花菜中溶至发酵液中，溶出速率大于降解速率；2 d后总糖持续下降，总酸质量分数迅速增加，说明原料迅速发酵，总糖降解快速，同时总酚质量浓度快速增加，说明发酵过程可以显著提高酵素中的总酚质量浓度；发酵至第6天时，总酸质量分数与多酚质量浓度达到最大值，之后趋于稳定。综合考虑，发酵时间选择6 d。除黄花菜酵素外，已有报道表明在蓝莓酵素、葡萄酵素天然发酵过程中总酚质量分数呈逐渐上升趋势，发酵结束后二者的总酚质量浓度分别为1.74和2.31 mg/mL[4-5]。

图9 发酵时间对总糖、总酸质量分数的影响

图10 发酵时间对总多酚质量浓度的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 试验设计方案及结果

响应面试验设计及统计结果见表2。利用统计软件Design-Expert 8.0.6.1进行试验设计和数据分析[6]。

表2 Box-Benhnken试验设计及响应值的实测值

2.2.2 模型方程的建立及变量分析

利用统计软件Design Expert对试验数据进行分析，可得到各因素与总酸、总多酚质量分数之间的回归方程式，通过对响应面数据进行回归分析，拟合后得到二次多项回归方程（1）和（2）：

由表3可知[7]：从方差分析可见，试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性（p＜0.0001），总酸校正决定系数（R2）为0.993，总多酚校正决定系数（R2）为0.9795，表明应变量与自变量之间的多元回归关系显著，此模型拟合度好，说明试验设计合理，该回归模型可代替试验真实点设计试验。因此在确定最佳工艺时，以总酸、总多酚作为主要考察对象，通过对回归系数的校验，影响产品总酸的因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度；影响产品总多酚的因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度。

表3 回归模型方差分析

2.3 交互作用分析

2.3.1 三因素对产品总酸的影响

为了研究三因素的变化与响应值之间的关系，通过固定一个因素为0水平，研究另外两个因素的交互作用，得到三维立体图。根据这些方程得到三因素的交互效应三维立体图和等高线图，考察响应面图的形状。等高线的形状反映交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形与之相反[9]。由图11等高线图可以看出：这3个因素间的交互作用不显著，这与回归模型方差分析的计算结果一致。随着接种量增加，产品总酸先增加后减小，总酸质量分数变化是由发酵过程中乙酸、乳酸等有机酸质量分数增加所致[10]，因此菌种浓度在一定范围内会促进发酵反应，总酸质量分数增加，但是当增加到一定浓度时，菌种代谢消耗营养物质大于代谢产物积累，因此总酸质量分数减少；随着发酵时间延长，总酸质量分数不断增加，说明发酵时间有利于总酸的积累；发酵温度提高，总酸质量分数是先增大后减小的。

图11 三因素对产品总酸的影响

2.3.2 三因素对产品总多酚的影响

总多酚是产品潜在功能性的表现，很多研究表明多酚类物质在抗诱变、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等方面具有显著的作用[11]。黄花菜多酚对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基均具有一定的清除作用，且清除率与黄花菜多酚浓度呈量效关系[12]，因此尽可能保留总多酚质量分数对黄花菜发酵具有重要意义。

从图12等高线图可看出：接种量与发酵温度近似圆形，因此交互作用不明显，接种量与发酵时间、发酵温度与发酵时间呈椭圆形，有一定的交互作用。从图12响应面图可知：随着接种量增加，产品总多酚先增加后减小，这是由于菌种浓度在一定范围内会促进发酵反应，总酸质量分数增加，但是当增加到一定浓度时，菌种代谢消耗营养物质大于代谢产物积累，因此总酸质量分数减少；随着发酵时间延长，总多酚质量浓度不断增加，说明发酵时间有利于总多酚的积累，但是发酵后期总多酚浓度分数减少，原因可能是时间过长，多酚发生降解、氧化等化学反应致使多酚分子结构发生一定的破坏；发酵温度提高，总多酚质量浓度先增大后减小。

图12 三因素对产品总多酚质量浓度的影响

2.4 最佳工艺条件下验证试验

为了验证模型的有效性，利用SAS 8.0软件的优化功能，得到发酵液接种量0.53%、发酵温度37.5 ℃、发酵时间6.2 d。在最优工艺条件下进行验证性试验，由表4可知，总酸、总多酚实测值与预测值相差较小，对结果进行修正，说明此模型有效。

表4 最佳工艺条件下验证试验

3 结论

以黄花菜乳酸发酵总糖、总酸、总多酚为评价指标，通过单因素试验考察5个因素对产品品质的影响。结果表明，料液比6%，蔗糖添加量3%，菌种接种量0.5%，在37 ℃下发酵6 d，效果较好。利用Box-Behnken统计学试验设计方法建立了总酸、总多酚的二次多项数学模型。影响产品总酸的因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度；影响产品总多酚的因素主次顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度。通过对模型方程3D图及其等高线图的分析，明确了因素间交互作用并获得了最佳处理条件。结果表明：发酵时间、接种量、发酵温度对总酸的影响交互作用不显著；接种量与发酵温度对总多酚的影响交互作用不明显，接种量与发酵时间、发酵温度与发酵时间对总多酚的影响有一定的交互作用。利用模型方程可以预测黄花菜乳酸发酵总酸质量分数、总多酚质量浓度变化趋势，方程预测值与实际值之间具有较好的拟合度，其最优工艺参数为接种量0.53%、发酵温度37.5 ℃、发酵时间6.2 d，在此条件下总酸实测值为18.7 g/kg，总多酚实测值为83.4 mg/100 mL。