CD56、Galectin-3、CK19及HBME-1蛋白在诊断甲状腺乳头状微小癌和非典型滤泡上皮增生中的价值*

黄力营,林清群,凌雪君,李发来,王木兰

贺州市人民医院 1病理科,2腺体外科,3科教科(广西贺州 542800)

甲状腺乳头状微小癌(papillary thyroid micro carcinoma，PTMC)定义为10 mm以下的甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)。目前的研究证实甲状腺良性疾病可能增加患甲状腺癌的风险，尤其是在甲状腺功能亢进或减退、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿和甲状腺炎[1]。鉴于在上述甲状腺良性病变中常常观察到伴有PTC样细胞核改变和(或)伴有乳头状结构形成的非典型滤泡上皮增生(atypical follicular epithelial proliferation，AFEP)改变[1-2]，且在结节性甲状腺肿和桥本甲状腺炎(hashimotos thyroiditis，HT)中的AFEP显示出具有肿瘤性质的单克隆性增生[2-3]，这意味着形态学上有时很难区分出非典型增生和恶性病变。在日常甲状腺病变诊断工作中，我们经常见到PTMC与滤泡上皮非典型增生的诊断和鉴别诊断，一个是恶性，一个是恶性潜能，治疗上有很大差异。因此我们采用免疫组化技术联合检测PTMC和良性甲状腺病变局灶伴非典型滤泡上皮增生病变中CD56、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、细胞角蛋白19(Cytokeratin 19，CK19)和人骨髓内皮细胞标记物(HBME-1)蛋白的表达，探讨它们在PTMC与甲状腺良性病变伴非典型滤泡上皮增生诊断和鉴别诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取贺州市人民医院病理科2016年4月至2019年2月期间收到手术切除甲状腺病变标本经确诊的PTMC材料共45例(其中34例合并结节性甲状腺肿，5例合并甲状腺腺瘤，6例合并桥本甲状腺炎)，肿瘤最大径0.5～9 mm，平均(2.89±2.461)mm。45例中40例为常规送检标本，5例为术中冰冻切片送检标本。男8例，女37例，年龄22～67岁，平均(48.24±11.70)岁。取同期手术切除诊断甲状腺良性病变伴局灶非典型滤泡上皮增生病例共30例(其中伴发结节性甲状腺肿25例，甲状腺腺瘤3例，桥本甲状腺炎 2 例)，男5例，女25例，年龄19～65岁，平均(45.27±13.76)岁。PTMC组与非典型滤泡上皮增生组之间患者年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 免疫组化试剂和方法 标本经10%中性甲醛固定，常规脱水、包埋，切片厚5 μm，行HE染色和免疫组化染色。免疫组化采用EnVision法，一抗CD56(MX039)、Galectin-3(9c4)、CK19(A53-B/A2.26)、HBME-1和EnVision(Kit-9922)检测试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，实验操作严格按说明书进行。用已知甲状腺乳头状癌Galectin-3、CK19和HBME-1阳性和小细胞肺癌CD56阳性切片作阳性对照，以PBS液取代一抗作阴性对照。

1.3 结果判定 以下染色模式被认为是阳性的：CD56以细胞膜的染色、Galectin-3细胞质和细胞核、CK19和HBME-1在细胞质和细胞膜染色，结果判读采用人工计数方法进行阳性细胞百分比和染色强度的计分。阳性细胞百分比按视野内阳性细胞所占总细胞数的比例计分：无着色细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分、51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度按阳性细胞着色特征记分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色强度与着色细胞比例两组分值相加，0分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件，两组间染色强度表达差异比较采用Mann-WhitneyU检验，率等计数资料的组间比较采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD56在PTMC与良性甲状腺病变局灶上皮非典型增生中的表达 CD56表达细胞膜，在PTMC中的阳性表达率为6.6%(3/45)，其表达强度3例均为弱阳性，无中至强阳性表达模式，而PTMC旁周围良性病变甲状腺滤泡上皮中常呈中度而完整的细胞膜表达(图1)；在良性甲状腺病变伴滤泡上皮非典型增生病变中的阳性率高达100.0%(30/30)，其中中等阳性表达为23例，强阳性表达5例，无阴性表达病例(表1)。滤泡上皮非典型增生组中CD56的阳性表达率和染色强度均显著高于PTMC组(P<0.001)。见表1。

2.2 Galectin-3、CK19和HBME在PTMC与良性甲状腺病变伴微小上皮非典型增生中表达 Galectin-3、CK19主要在细胞质中表达，Galectin-3伴有核表达。HBME-1主要表达在细胞膜，包括细胞腺腔面、乳头或侧膜部位的细胞膜表面，伴或不伴有胞质着色(图1)。免疫组化结果显示，Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC中的阳性表达率分别为100.0%(45/45)、100.0%(45/45)和88.8%(40/45)，阳性表达模式均以中至强阳性表达为主，其中中至强阳性表达率分别为95.6%(43/45)、100.0%(45/45)和60.0%(27/45)；而在滤泡上皮非典型增生病变中均无强阳性表达，中度阳性表达则仅分别为3.3%(1/30)和26.7%(8/30)，且HBME-1无中度阳性表达病例。值得注意的是，Galectin-3 在良性病变、PTMC及非典型增生周围的正常甲状腺组织均呈阴性。而CD19在PTMC中77.7%(35/45)染色模式以强而弥漫的阳性表达为主，在非典型增生中呈中度阳性表达占26.6%(8/30)，但其阳性染色呈局灶斑驳状缺乏弥漫性，在良性病变、PTMC及非典型增生周围正常甲状腺组织中可见散在不规分布灶性滤泡上皮胞质中弱阳性表达。HBME-l在PTMC中表达的特征是弥漫中至强阳性信号连接成线状，而非典型增生病变中为局灶状弱阳性表达，在良性病变及周围正常甲状腺组织均为阴性表达。PTMC中Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白的阳性表达率和染色强度显著高于滤泡上皮非典型增生组(P<0.001)。见表1。

注：A：CD56在PTMC中(-)；B：Galectin-3在PTMC强(+)；C：CK19在PTMC强(+)；D：HBME-1在PTMC中等(+)(EnVision，×100)；E：CD56在AFEP中等(+)；F：Galectin-3在AFEP中(-)；G：CK19在AFEP中等(+)；H：HBME-1在AFEP中(-)(EnVision，×100)图1 CD56、Galectin-3、CK19及HBME-1蛋白在PTMC和非典型滤泡上皮增生中的表达

表1 CD56、Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC组和AFEP组中的表达 例

2.3 CD56和Galectin-3、CK19、HBME-1标记物组合在PTMC中的表达情况 PTMC组中Galectin-3、CK19、HBME-1三种标记物同时阳性表达为88.8%(40/45)，而Galectin3/CK19、CK19/HBME-1和Galectin3/HBME-1组合双阳性率分别为100.0%(45/45)、88.8%(40/45)和88.8%(40/45)。结果显示CD56阴性、Galectin-3/CK19双阳性组合的特异度为93.4%(42/45)，且以中至强阳性染色模式为主，而CD56阴性、CK19/HBME-1或Galectin3/HBME-1双阳性组合的特异度均为82.2%(37/45)。而在良性病变伴非典型滤泡上皮增生组中CD56均为阳性表达，其中中至强阳性表达为93.3%(28/30)，但无Galectin-3、CK19、HBME-1组合中双阳性表达的病例。

3 讨论

甲状腺乳头状癌中是否存在癌前病变仍存在争议，有数据表明，一些良性结节可能具有恶性潜能，并可能具有从良性到恶性的多灶性进展。在结节性甲状腺肿良性背景中和PTC周围组织中已证实有显微镜下小的非典型滤泡上皮增生癌前病灶的存在[4-5]。Hunt等[6]在慢性淋巴细胞性甲状腺炎的非典型增生区域观察到抑癌基因的杂合缺失突变，表明这些非典型区域是肿瘤性而非反应性区域。已在一些组织病理学分类的良性结节中被证实存在有包括Gal-3、CITED1、HBME-1、Ras、RET/PTC和PAX8/PPARc等肿瘤标志物和遗传突变呈阳性，已有学者将其命名为非典型滤泡上皮增生/甲状腺滤泡上皮异型增生(follicular epithelial dysplasia，FED)以与反应性增生相区分[2，7]。

PTC可根据典型的核形态在细胞学和组织标本中进行诊断。这些形态在某些PTC变型中可能并不突出，而在某些良性病变下可能会看到，本组中非典型滤泡上皮增生以伴随在结节性甲状腺肿中为主，可能与地处广西桂东地区有关，由于地理环境因素的关系，本地区人口桥本甲状腺炎的发病率并不高，而结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤多见。由于病变微小，在甲状腺良性病变中从形态学上，将具有PTC样部分核特征的非典型滤泡上皮增生与PMTC鉴别开来，对病理学家是一个挑战。

CD56是免疫球蛋白超家族的一员，CD56蛋白在正常甲状腺滤泡上皮细胞中表达，而在甲状腺癌中则常表达下调或缺乏。以往报道其在PTMC中阳性率为0～60.0%，甲状腺良性疾病中为91.7%～100.0%[8]。在我们的研究中，CD56在PTMC中阳性表达率仅为6.6%(3/45)且为弱阳性染色，无中至强阳性染色模式。而在非典型滤泡上皮增生病变中均为阳性表达，其中中至强阳性表达率为93.3%(28/30)。统计学显示非典型滤泡上皮增生组中CD56的阳性率和染色强度均显著高于PTMC组(P<0.001)。这些结果表明，CD56表达下调在甲状腺良恶性肿瘤中的诊断和鉴别诊断中具有重要的价值，根据阳性表达情况和染色强度模式有助于我们将良性病变中非典型滤泡上皮增生与PTMC区分开来。

Galectin-3是β-半乳糖苷结合蛋白家族的成员，其涉及了甲状腺上皮的恶性转化过程，目前的研究的热点集中于其在甲状腺癌的血清学诊断标记物。以往的研究表明，Galectin-3在PTMC中阳性率为45.7%～98.0%，但在良性病变和正常甲状腺组织中不表达，这对PTMC与甲状腺良性病变的鉴别诊断非常有价值[8-9]。我们的研究显示，Galectin-3在PTMC均为阳性，且中至强阳性表达占95.6%(43/45)，而非典型增生6例阳性中5例为弱阳性，仅1例为中度强度的染色模式，PTMC组中Galectin-3的阳性率和染色强度均显著高于非典型增生组(P<0.001)，除作为鉴别PTMC与AFEP的有效指标外，其在非典型增生病变中的表达提示该病变可能具有分化为恶性的潜力。

以往的报道CK19在PTMC中的阳性率为59.0%～84.0%且呈强而弥漫阳性着色模式，而在甲状腺良性病变中缺乏或低表达[10]。本组中CK19在PTMC中均呈中至强而弥漫膜阳性表达模式，而非典型增生组中阳性着色模式呈局灶斑驳状，即使在经冰冻切片处理后的微小癌组织病灶中也是如此。我们认为在鉴别PTMC与非典型增生时结合细胞学形态特征以及CK19染色强度和模式对区分两者十分重要，当CK19呈强而弥漫染色模式时，对PTMC的诊断有提示作用。同时，尽管CK19在PTMC中的阳性率和染色强度均显著高于非典型增生组(P<0.001)，但后者阳性表达亦达46.6%(14/30)，其中26.6%(8/30)呈中度阳性染色模式，表明非典型增生中的CK19的阳性表达提示其可能是一种癌前病变，具有与PTC相似的分子病理改变[2-3]。

HBME-1是一种存在于间皮瘤和滤泡性甲状腺肿瘤细胞微绒毛中的膜蛋白。以往的研究证实在PTC患者中的表达明显高于良性甲状腺病变患者[11]。本研究显示PTMC组中HBME-1阳性率和阳性表达强度均显著高于非典型增生组(P<0.001)。我们体会到在恶性病变中，HBME-1在膜(腔内)线性染色更常见，其以弥漫性、线性和腺腔面、侧膜、乳头顶端强膜性染色是PTMC与非典型增生鉴别有效的标记物之一。

由于PTMC本身病灶微小，形态学鉴别PTMC与非典型增生存在困难，运用该组合检测在CD56阴性的状态下，当Galectin3、CK19、HBME-1这3个标记物中同时或3个中任意2个组合同时出现强而弥漫阳性表达模式时，即可诊断为PTMC而不诊断非典型增生，这可有效辅助我们将PTMC与AFEP鉴别开来，并为临床开展个性化的监测策略和治疗决策提供帮助。