头孢曲松对大鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障及神经细胞凋亡的影响

刘乙璇，龚泽华，冯思国，李建民，王婧瑶，刘俊杰

（华北理工大学1临床医学院；2附属医院神经外科，河北 唐山 063000）

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一类临床上常见且致死致残率极高的神经外科疾病[1]。研究表明在SAH 发病过程中起主要作用的是早期脑损伤（early brain injury, EBI），表现为患者脑组织水肿、脑血管痉挛和血－脑脊液屏障受损等病理生理改变[2]。寻找切实有效的治疗药物及调控靶点是目前研究重点。YUAN 等研究发现SAH 后血脑屏障的破坏与脑损伤的发展和不良的临床结果密切相关[3]。近年研究表明头孢曲松（ceftriaxone，CEF）这一β-内酰胺类的抗生素对于脑损伤也具有一定的保护作用[4]，但其机制尚未阐明。本实验通过建立大鼠SAH 模型，研究CEF 对SAH 后血脑屏障通透性、脑组织含水量及皮质细胞凋亡等方面的影响，从而为临床SAH的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药头孢曲松(齐鲁制药有限公司，批号：0080418)；兔抗Caspase-3 多克隆抗体（美国Santa Cruz 公司，批号：SC-7148）、兔抗MMP-9 多克隆抗体以及相应二抗（美国Santa Cruz 公司，批号：SC-21733）；化学发光试剂盒（美国Solarbio 公司，批号：SW2020）；TUNEL 试 剂 盒( 瑞 士Roche 公 司，批 号20200614)；820-Ⅱ型切片机（德国Leica 公司）；TP-1型摊片机（天津天利机电公司）；Motic-6.0 图像采集及分析系统（日本OLYMPUS 公司）；摄影生物光学显微镜（日本NIKON 公司）；低温离心机（上海金坛市医疗仪器厂）；酶标仪（北京普天新桥技术有限公司）；电泳仪、电转槽、化学发光显色系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 实验动物48 只健康雄性SD 大鼠，体质量（270±10）g，购自北京维通利华，实验动物生产许可证号：2019-002。

1.3 模型制备用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉SD 大鼠，仰卧位固定，颈正中做切口，依次分离颈总、颈外、颈内动脉，离断颈外动脉，从颈外动脉近心残端刺入4-0 锐化手术缝合线，插入18～20 mm后到达大鼠大脑前动脉和大脑中动脉交界处，感受到一定阻力后穿破血管壁，再刺入3 mm 制成SAH 手术模型。假手术组大鼠进行同样的手术操作，但不刺破血管。操作结束后立即拉出穿刺线，恢复正常的血液灌注，使用呼吸机维持大鼠呼吸，直到大鼠能够正常呼吸。术后72 h 后取材，SAH 手术模型制作成功的表现为蛛网膜下腔出现血凝块；若不合格则剔除实验。

1.4 分组与给药将建模成功的48只大鼠随机分为4组：假手术组（Sham组）、SAH模型组和头孢曲松低、高剂量组（分别给予CEF，50、200 mg/kg）。头孢曲松低、高剂量组大鼠在术后0.5、24 和48 h，分别腹腔注射给予CEF 50 和200 mg/kg 体质量，假手术组及SAH模型组大鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL。

1.5 指标的测定

1.5.1 神经功能评分[5]根据Garcia 评分系统，评估SAH 后神经功能损伤程度。得分越高，相对应的大鼠神经损伤程度越轻。测试项目包括自主运动检测、四肢活动检测、前爪运动及力量、身体的本体感觉、攀爬实验、和触觉试验检测。前3项各项得分0～3，后3 项各项得分1～3。6 项测试所得分数相加即为评分。评分分为3个等级：1～6分为神经功能重度损伤，7～12 分为神经功能中度损伤，13～18 分为神经功能轻度损伤。

1.5.2 脑组织含水量测定 造模72 h后处死大鼠，脑组织立即被分成左右大脑半球、脑干和小脑。称湿重后脑标本放进烤箱中于105 ℃的环境干燥72 h，再称脑组织干重。干湿重法测量脑组织含水量: 脑含水量（%）＝（脑组织湿重－脑组织干重）／脑组织湿重×100%。

1.5.3 脑组织凋亡神经细胞的检测 72 h 后取病灶侧脑组织，用多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片。根据试剂盒说明，进行TUNEL 染色。切片行常规预处理，使用过氧化氢室温封闭10 min；PBS洗涤，随后滴加平衡缓冲液，风干多余液体立即滴加工作强度转移酶充分覆盖组织，并置于湿盒中温箱孵育1 h，使用洗涤液停止反应；最后滴加抗地高辛氧化酶经室温孵育30 min 后荧光染色。镜下观察并摄片，每张切片在海马CA1 区随机选取5 个视野，进行TUNEL阳性细胞计数，即为凋亡细胞数量。

1.5.4 脑组织中Caspase‑3和MMP‑9蛋白的测定取大鼠血凝块周围脑组织，加入裂解液（脑组织体积∶裂解液=1∶4）置于匀浆机内充分研磨后，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min提取蛋白。使用BCA 法定量海马蛋白含量，配制上样缓冲液，行电泳分离蛋白，并转移到硝化纤维素膜上。封闭液封闭膜，兔抗大鼠的Caspase-3、MMP9（1∶1 000）多克隆抗体4 ℃孵育12 h，1∶2 000 的二抗在常温下孵育1 h，化学发光试剂盒检测条带。用Image J 软件进行密度测定，定量分析Blot 条带。β-肌动蛋白（1∶2 000；Santa Cruz）作为内参对照。

1.6 统计学处理采用SPSS22.0 统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较与Sham 组比较，SAH 组的Garcia 评分降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH 组比较，SAH＋CEF 低、高剂量组神经功能评分升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH＋CEF 低剂量组比较，SAH＋CEF 高剂量组神经功能评分升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分（-x±s，n=12）

2.2 各组大鼠脑组织含水量的比较与Sham 组比较，SAH 组大鼠脑组织的水含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH 组比较，SAH＋CEF 低、高剂量组脑组织水含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH＋CEF 低剂量组比较，SAH＋CEF 高剂量组脑组织水含量降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组大鼠脑组织含水量的比较（-x±s，n=6，%）

2.3 各组大鼠脑组织TUNEL 染色结果与Sham 组比较，SAH 组TUNEL 阳性细胞数升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与SAH 组比较，SAH＋CEF 低、高剂量组TUNEL阳性细胞数减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH＋CEF 低剂量组比较，SAH＋CEF 高剂量组TUNEL阳性细胞数减少，差异有统计学意义（P<0.05），见图1，表3。

表3 各组大鼠凋亡细胞数的比较（-x±s，n=6）

图1 各组大鼠Tunel染色图

2.4 CEF 对各组大鼠Caspase-3、MMP-9 蛋白表达的影响与Sham 组比较，SAH 组病灶处脑组织MMP-9和Caspase-3蛋白表达量增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAH 组比较，SAH＋CEF 低、高剂量组MMP-9和Caspase-3蛋白的表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），与SAH＋CEF 低剂量组比较，SAH＋CEF 高剂量组MMP-9 和Caspase-3 蛋白的表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）,见图2，表4。

图2 各组大鼠出血区MMP-9、Caspase-3蛋白的表达

表4 各组大鼠出血区脑组织MMP-9、Caspase-3蛋白表达量比较（-x±s，n=6）

3 讨论

目前研究认为早期脑损伤是影响SAH 预后的主要因素，包括脑水肿、血脑屏障破坏等。其中脑水肿被证实为SAH 后死亡和不良预后的主要危险因素[6]。同时有研究表明，SAH 后脑水肿主要是血管源性的，即血脑屏障功能障碍所致[7]。因此SAH 后血脑屏障的破坏与脑损伤的发展和不良的临床结果密切相关[8]。但其机制未明且缺乏干预措施。本研究发现CEF 治疗后，脑水肿程度明显减轻，且高剂量效果更为显著。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase ,MMPs）可由多种细胞生成，如血管内皮细胞、神经细胞、胶质细胞等。 MMP-9 被认为是功能最大的MMP，可降解脑基底膜，且在维持血管完整性中脑基底膜起到主要作用[9]。Gregory 等[10]研究发现MMP-9可水解血脑屏障紧密连接的主要成分Ⅳ型胶原，从而破坏血脑屏障。其中血管内皮细胞间紧密连接以及基底膜的完整是血脑屏障结构和功能的保障。SAH后，早期即有MMP-9蛋白表达量明显升高，破坏血脑屏障的完整性而导致血管源性脑水肿的发生[11-13]。本研究结果发现，CEF 治疗后SAH 脑组织中MMP-9的表达量明显的减少，且高剂量组更为显著。提示降低MMP-9 的表达可能是CEF 减轻SAH 大鼠脑水肿的重要机制。

大量研究发现，CEF在一些中枢神经系统疾病中比如脑外伤、脑卒中等均具有神经保护作用[14-16]。张帆等[17]研究表明在中枢神经系统损伤，过量的谷氨酸所造成的神经兴奋性毒性可损害神经元细胞，影响神经功能，而CEF 可提高兴奋性氨基酸转运体（EAAT）的表达，维持细胞外谷氨酸浓度在正常水平，并清除神经传递过程中释放的谷氨酸盐[18]。Xhi‑ma 等[19]研究表明，谷氨酸的兴奋性毒性可破坏血脑屏障的完整性，使血脑屏障的通透性增加。SAH 诱导严重的谷氨酸兴奋性毒性，脑脊液中谷氨酸浓度迅速增加，血脑屏障也受到严重破坏，从而导致脑水肿的发生。陈旭等[20]研究发现作为FDA 批准的β-内酰胺类抗生素，CEF 增加EAAT 基因的转录并增强EAAT 的表达，从而使谷氨酸的兴奋性毒性降低，起到神经保护作用。本研究结果发现，CEF治疗后SAH大鼠的神经功能评分明显提高，且呈剂量依赖型。提示CEF 治疗对SAH 大鼠具有神经保护作用。结合本实验结果，提示CEF 治疗可能通过提高EAAT 的表达降低谷氨酸的兴奋性毒性，从而改善血脑屏障功能，减轻脑水肿。

本实验还发现，CEF治疗后凋亡神经细胞数量明显减少，凋亡因子Caspase-3 的表达也相应减少，且呈剂量依赖性，高剂量CEF 治疗，神经细胞凋亡明显减少。提示CEF 治疗可减轻神经细胞凋亡，减少神经细胞的丢失，从而改善神经功能。综上所述，CEF可能通过降低谷氨酸的兴奋性毒性，抑制MMP-9 蛋白表达，改善血脑屏障的功能，减少神经细胞凋亡来缓解SAH 后早期脑损伤。本研究结果可能为CEF 临床用于SAH 的治疗提供了实验依据。