灯盏花素对COPD小鼠模型气道平滑肌细胞增殖的影响

石露露，韩卫南，王 强，许宁宁

（张家口市第一医院药学部，河北 张家口 075000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmori‑ary disease，COPD）的特征是气流受限，其与气道对有害颗粒或气体的慢性炎症反应增强有关，临床上尚无特效治疗方法[1]。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMC）的过度增殖会引起气管功能障碍，并参与气道重塑和气道高反应性[2]。在COPD 患者的支气管分泌物中检测到肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）升高，其可以通过TNF 受体（TNF receptor，TNFR）激活核因子（nuclear factor，NF）-κB，上调靶基因的表达参与炎性反应，如磷脂酶A2 等[3]。近年来研究显示TNF-α/TNFR/NF-κB 途径也可以诱导ASMC的过度增殖[4]。灯盏花素是一种从中草药中分离得到的类黄酮糖苷混合物，其药理作用包括缓解机体高凝状态、调控氧化应激反应和炎性反应等[5]。已有研究显示灯盏花素可以缓解COPD病情并调控患者免疫水平，改善预后[6]，但是灯盏花素缓解COPD 的机制以及其对ASMC 的影响仍不明确。本研究主要基于TNF-α/TNFR/NF-κB 途径探讨灯盏花素对COPD 动物模型气道平滑肌细胞增殖的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料C57BL/6 小鼠，雄性，4 周龄，湖北省实验动物研究中心，SCXK(鄂)2015-0018。脂多糖（美国Sigma 公司）。香烟（红塔集团，烤烟型）。灯盏花素注射液（神威药业，Z13020778）。小动物肺功能仪（拜安吉）。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）HE试剂盒（碧云天）。RNAspin Mini 试剂盒（美国GE Healthcare）。Bestar qPCR RT 和Bestar™qPCR 试剂盒（德国DBI Bioscience）。Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统（美国Santa）。一抗和山羊抗兔HRP–IgG二抗（ab205718）（美国Abcam）。PVDF膜（中国香港JS0344，JSENB）。ECL 显色试剂盒（美国Ther‑mo Fisher）。 小鼠ASMC 细胞（美国ATCC 公司）。NF-κB 抑制剂EVP4593（美国Selleck 公司）。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）试剂（RiboBio）。

1.2 建模将45 只小鼠分为3 组：对照组、COPD 组和COPD+灯盏花素组，每组15 只。通过鼻腔滴入脂多糖(LPS)和香烟环境诱导建立COPD 模型[7]，在实验第1周、第5周和第9周的第1天滴入30 µg的LPS，然后将小鼠放置在熏箱中（0.7 m×0.5 m×0.4 m），熏箱中放入点燃香烟，每次10 支，每日1 次，连续12 w。COPD+灯盏花素组小鼠在建模后使用灯盏花素腹腔注射，每次剂量按灯盏花素计算为48 mg/kg，每日1次，连续4 w[8]。

1.3 观测指标

1.3.1 气道反应性检测 小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（1%，70 mg/kg）麻醉，切开气管插入导管连接到肺功能检测仪上，检测和记录气道阻力。

1.3.2 增殖细胞核抗原检测（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）小鼠颈脱臼处死后取出肺组织，用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋在石蜡中，制成厚度为5 µm 的组织玻片标本。用Mayer's 苏木精在室温下染色10 min，然后用0.5% 的曙红室温下染色3 min。将切片在-20°C 的冷丙酮中固定15 min。然后在37°C 下与抗小鼠PCNA 抗体孵育1 h，然后使用IgG 试剂显色，最后利用苏木精复染细胞核，棕色和黄色染色代表阳性细胞。

1.3.3 mRNA 检测 从组织中提取RNA，使用Bestar qPCR RT 试剂盒将其逆转转录为cDNA，条件如下：37 °C /15 min；98 °C /5min。然后使用Bestar™qPCR预混液进行qPCR 实验，条件如下：95 °C/2 min，94 °C/ 20 s，58 °C 20 s，72 °C/20 s，40 个循环，最后在72 °C 下 延伸4 min。使 用Agilent Stratagene Mx3000P 序列检测系统进行RT-qPCR 分析。GAPDH 作为内源参照，通过比较循环阈值评估mRNA水平。

1.3.4 蛋白检测 将气管组织研磨后萃取总蛋白并检测浓度，然后分别取总量为40 µg 的总蛋白进行分离，分离条件为10% 的聚丙烯酰胺凝胶、80~120 V、90 min。然后通过湿法进行转膜，在100 mV 下将分离的蛋白转移到PVDF膜上。将一抗稀释500倍后分别加入膜中并在4 °C 下孵育过夜。洗涤后加入山羊抗兔HRP –IgG 二抗室温孵育1 h。本研究内参为GAPDH，分析目标蛋白条带相对于GAPDH 的灰度值分析蛋白表达水平。

1.3.5 细胞增殖检测 将ASMC分为空白组、模型组、模型+灯盏花素组和模型+灯盏花素+ EVP4593 组。在培养基中加入4% 的香烟提取物和0.1 µg /mL 的脂多糖诱导体外COPD 模型培养24 h[9]，其中培养基中灯盏花素的终浓度为50 mg/L。对于模型+灯盏花素+ EVP4593 组，在培养前加入10 µmol/L 的NF-κB抑制剂EVP4593 预培养48 h。4 组细胞用EdU 试剂处理2 h，进行染色，细胞核使用Hoechst 染色。然后在荧光显微镜下随机选择5 个高倍视野拍照观察，计算细胞增殖比例（=新增殖细胞/总细胞数目×100%）。

1.4 统计学处理所有实验进行3 次平行实验。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。 统计分析使用SPSS 19 软件。多组间比较进行方差分析，两两比较使用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组小鼠气道阻力比较COPD 组50 mg/mL 和100 mg/mL 条件下的气道阻力[（9.94±1.67）cm H2O×s/mL，（18.94±2.13）cm H2O×s/mL] 显 著 高 于 对 照 组[（5.72±0.94）cm H2O×s/mL，（10.15±1.39）cm H2O×s/mL]（P<0.05），COPD+灯盏花素组的气道阻力[（7.15±1.28）cm H2O×s/mL，（13.78±1.86）cm H2O×s/mL]显著低于COPD组（P<0.05），见表1。

表1 3组小鼠气道阻力比较/（cm H2O×s/mL）

2.2 3 组小鼠肺组织和气管病变比较对照组小鼠肺组织细胞染色均匀、细胞形态正常、排列规则，肺泡结构清晰，支气管壁细胞排列有序，厚度均匀。COPD 组肺泡结构紊乱，支气管壁明显增厚。COPD+灯盏花素组肺组织损伤情况和气管病变情况较COPD组轻。见图1。

图1 3组小鼠肺组织和气管病变比较（×100）

2.3 3组小鼠PCNA 蛋白表达水平比较COPD 组小鼠ASMC 的PCNA 染色水平显著升高，COPD+灯盏花素组的PCNA表达水平低于COPD组。见图2。

图2 3组小鼠PCNA蛋白表达水平比较(×100)

2.4 3 组小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB 转录水平比较3 组小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB mRNA 转录水平比较差异均有统计学意义（P<0.05）。 COPD 组的TNF-α、TNFRmRNA、NF-κB mRNA 显著高于对照组（P<0.05），COPD+灯盏花素组显著低于COPD 组（P<0.05），见表2。

表2 3组小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB mRNA转录水平比较

2.5 3组小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB蛋白表达水平比较3 组小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 通路中蛋白表达水平比较差异均有统计学意义（P<0.05）。COPD组的TNF-α、TNFR 、NF-κB 蛋白水平显著高于对照组（P<0.05），COPD+灯盏花素组显著低于COPD 组（P<0.05），见表3、图3。

表3 3组小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 蛋白表达水平比较

图3 3组小鼠TNF-α、TNFR、NF-κB 蛋白表达水平比较

2.6 TNF-α/TNFR/NF-κB 通路对ASMC 增殖的影响4组ASMC 增殖情况比较差异均有统计学意义（P<0.05），其中模型组的增殖率[（41.26±3.58）%]显著高于空白组[（15.85±1.87）%]（P<0.05），模型+灯盏花素 组 的 增殖 率[（30.64±3.06）%] 显 著 低 于 模 型 组（P<0.05），模型+灯盏花素+EVP4593 组的增殖率[（22.18±4.02）%]显著低于模型+ 灯盏花素组（P<0.05）。见图4。

图4 TNF-α/TNFR/NF-κB通路对ASMC增殖的影响（×400）

3 讨论

COPD 已成为主要的国际卫生问题，其患病率和死亡率日渐增多[10]。 COPD 最常见的症状为长期咳嗽、咳痰、呼吸急促和呼吸困难。气道上皮细胞增殖会引起气管壁增厚、气道重塑和高反应性，是COPD的主要发病机制之一[11]。灯盏花素（C42H36O23）是从灯盏花中提取的一种黄酮类化合物，其具有扩张毛细血管、减少血小板凝集、清除自由基和改善微循环的作用[12]。临床研究已经显示了灯盏花素可缓解急性COPD，并改善患者肺功能提高预后[13]。本研究利用LPS 和香烟构建了COPD 小鼠模型，并通过灯盏花素进行干预，结果显示灯盏花素可以明显的减少COPD模型小鼠阻力，缓解气管壁增厚，并且可以显著的抑制ASMC 的增殖。现阶段灯盏花素抑制细胞增殖的作用主要集中在肿瘤细胞中，研究显示灯盏花素具有抑制肝癌[14]和前列腺癌[15]的肿瘤细胞增殖的作用。此外，体外研究也证实了灯盏花素可以抑制肺癌细胞的增殖[16]。本研究结果提示灯盏花素缓解COPD的作用可能与抑制细胞增殖有关，可能通过抑制ASMC 的增殖缓解气道高反应，从而抑制气道重塑，进而缓解COPD。

为进一步分析灯盏花素抑制ASMC 增殖的机制，本研究检测了TNF-α/TNFR/NF-κB 通路表达水平。该通路在COPD 中发挥重要作用，一方面，是因为激活NF-κB 蛋白的转录功能，促进促炎因子的转录导致炎性反应[17]；另一方面，TNF-α 也可以通过NF-κB通路促进ASMC 的增殖[18]。本研究发现灯盏花素可以明显的抑制COPD 模型小鼠TNF-α/TNFR/NF-κB通路的转录和翻译水平。已有研究结果表明灯盏花素抑制了ASMC 的增殖，并且EVP4593 抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路后会进一步提高灯盏花素的抗增殖作用[19]。灯盏花素可通过抑制NF-κB 通路缓解脑损伤[20]。灯盏花素通过抑制LPS 诱导的BV-2 小胶质细胞中的NF-κB 途径来抑制神经炎症[21]。灯盏花素可通过抑制TNF-α表达和NF-κB的活化抑制滑膜细胞的增殖并抑制炎性反应[23]。以上文献研究结果提示灯盏花素具有抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的功效，而本研究结果则表明灯盏花素可能通过抑制TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的转录和翻译，来抑制炎性反应和抑制ASMC 增殖，从而发挥抗COPD 的作用。

综上所述，灯盏花素可能通过抑制TNF-α/TN‑FR/NF-κB 通路抑制ASMC 的增殖，进而减少气道阻力。关于灯盏花素调控TNF-α/TNFR/NF-κB 通路的机制得深入研究，这可能成为治疗COPD的新方法。