NE-IFISH法在胰腺癌循环肿瘤细胞检测中的价值

王 欣,曹军丽,佟明铭

(1.秦皇岛市中医医院 重症医学科,河北 秦皇岛066000；2.秦皇岛市第一医院 肿瘤科)

循环肿瘤细胞(CTCs)对疾病诊断和预后评估有重要意义，被认为是一种非侵入性的活检替代指标[1]。然而，外周血中的CTCs含量较少，检测难度高，检测前细胞富集是极为关键的一步。本研究通过对比Cell Search法和阴性富集联合免疫荧光染色体原位杂交(NE-IFISH)技术对胰腺癌CTCs的检测价值，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

秦皇岛市第一医院自2018年6月至2019年6月收治的41例胰腺癌患者，包括男性25例，女性16例，年龄41-80岁，平均(62.3±8.6)岁。所有患者均经影像学检查和穿刺活检诊断为胰腺癌的初诊病例，且未合并其他位置肿瘤。选择同期体检的40例健康志愿者为对照组，男性23例，女性17例，年龄42-78岁，平均(63.1±7.5)岁。两组一般资料比较无统计学差异(P>0.05)。

1.2 CTCs富集方法

使用专用的CTCs采血管采集空腹肘静脉血7.5 ml，室温下离心，离心力800 g，离心时间8 min，弃去上清，下方沉淀转移至离心管。采用移液器取3 ml CTCs分离液，加入离心管的底部，室温离心，离心力450 g，离心时间8 min。离心后有3层液体，弃掉底层的棕红色细胞，将上面两层转移至新的离心管，加入免疫磁珠，每管300 μl，室温摇床20 min。磁力架上混匀后，将液体再次转移至一个新的离心管，并加入CTCs富集缓冲液，颠倒混匀后，室温离心，离心力550 g，离心时间4 min，弃掉上清，再次加入CTCs富集缓冲液，重复离心一次。得到的CTCs富集样本分为两份，一份用于Cell Search检测，另一份用于NE-IFISH检测。

1.3 CTCs检测方法

Cell Search检测：利用美国Biolegend公司提供的Cell Search系统测定标本CTCs计数，CTCs判断标准为EpCAM+、CK+、CD45-、DAPI+。NE-IFISH检测：(1)弃上清，加2 μl染色液，震荡摇匀后静置20 min，加入抗体(组成为1 μl anti- CD45+1 μl anti- CEP-8+1 μl anti- CK18+1 μl Anti-h WBC+200 μl抗体溶剂)，避光孵育30 min。加入CTCs缓冲液，混匀后再次离心，550 g×4 min，弃上清，沉淀中加 CTCs固定液并涂片用于后续检测。(2)根据说明书要求配置FR1/FR2混合液，滴加于载玻片，避光孵育10 min，吸除多余液体，以FR3液清洗4次。无水乙醇脱水后，避光条件下滴加10 μl探针，封片后置入杂交仪，76℃变性10 min；37℃杂交4 h，去除封片胶，温浴脱除盖玻片。采用抗体洗涤液洗涤4次。滴加5 μl DAPI染色液标记细胞核，封片，显微镜下观察CTCs。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 22.0分析数据，本研究中CTCs数目不符合正态分布，以中位数(最小值-最大值)表示，行Mann-Whitney检验；CTCs阳性率采用百分比表示，组间比较行χ2检验；采用受试者工作曲线(ROC)分析CTCs的诊断价值；采用K-M法进行生存分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与对照组患者的CTCs检测结果

在41例研究组患者中，NE-IFISH法共检测到132个CTCs(33例患者阳性)，Cell Search法共检测到111个CTCs(29例患者阳性)，NE-IFISH法检测到的阳性率和CTCs总数略高于Cell Search法，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。但无论是NE-IFISH法还是Cell Search法，研究组的CTCs阳性率和CTCs数目均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 研究组与对照组患者的CTCs检测结果汇总

2.2 两种方法对胰腺癌的临床诊断与病情评估价值

如表2所示，NE-IFISH法与Cell Search法对胰腺癌发生，胰腺癌淋巴结转移、远处转移及分期Ⅲ-Ⅳ期均有较好的评估价值(AUC=0.658-0.890，P<0.05)，在诊断胰腺癌发生和评估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的应用价值优于Cell Search法，组间差异有统计学意义(P<0.05)。各个项目的ROC曲线详见图1。

表2 两种检测方法的临床诊断与预后评估价值

图1 两种检测方法诊断胰腺癌及其病理特征的ROC曲线

2.3 研究组患者手术前后的CTCs检测结果

手术后，NE-IFISH法检测到的阳性率和CTCs总数也略高于Cell Search法，但组间差异无统计学意义(P>0.05)；无论是NE-IFISH法还是Cell Search法，手术后的CTCs阳性率和CTCs数目均明显低于手术前，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 研究组患者手术前后CTCs检测结果

2.4 两种方法对胰腺癌的预后评估价值

本次研究共随访9-24个月，中位随访时间19个月，截止到末次随访，复发或转移27例，死亡11例，均死于复发或转移。根据术后CTCs检测情况，将患者分为CTCs阳性及CTCs阴性两组，绘制生存曲线，结果显示NE-IFISH法CTCs阳性和阴性患者的中位生存期分别为23个月和20个月，中位无进展生存期分别为22个月和15个月；Cell Search法CTCs阳性和阴性患者的中位生存期分别为22个月和17个月，CTCs阳性患者生存期均低于CTCs阴性患者(P<0.05)。详见图2。

图2 CTCs与胰腺癌术后生存的关系考察

3 讨论

Cell Search系统是唯一被美国食品及药物管理局(FDA)批准用于临床检测外周血CTCs的检测平台，但对胰腺癌CTCs的检测精度不佳，主要是因为胰腺癌为上皮间质转化比较活跃的肿瘤，在这一病理行为中上皮细胞特异性抗原EpCAM表达会减弱[2]。NE-IFISH检查通过CD45、CEP-8、CK18、DAPI 染色及杂交特异性来鉴别CTCs。CEP-8这一指标主要反映8号染色体的异常，既往有研究对16种胰腺癌细胞系的分析结果显示几乎所有细胞的8号染色体均存在异倍性，故而CEP-8可以作为胰腺癌细胞的重要特征，在鉴别胰腺癌CTCs方面具有较高的优势[3-4]。

曹旻璐等[5]采用Cell Search系统检测了7种肿瘤患者的CTCs情况，胰腺癌的术前和术后检出率分别为62.0%和25.0%。本研究采用Cell Search系统检测胰腺癌的术前和术后的CTCs检出率分别为70.7%和37.2%，而NE-IFISH法的阳性率分别为80.5%和58.5%。另外，CTCs可以衡量肿瘤负担，辅助病情诊断与预后评估的观点已被较多学者所证实[5-7]，本研究还发现在诊断胰腺癌发生和评估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的应用价值优于Cell Search法。在随访中发现CTCs阳性患者的生存期和无进展生存期均低于CTCs阴性患者。