miR-422a靶向激肽释放酶-4抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭

2021-10-27宋鹏霞李群锋曹焰晖姚水洪

天津医药 2021年10期

宋鹏霞，李群锋，曹焰晖，姚水洪

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康，2020年全球有60万新增病例和34万死亡病例［1］。目前，宫颈癌的发病机制尚不明确，研究其发生发展机制对临床诊治具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种能在转录后水平调控基因表达的非编码小分子RNA。miRNA 通常与靶基因mRNA 的3′非编码区（UTR）通过碱基互补的方式配对，进而抑制下游 mRNA 的降解或翻译［2］。miRNA的表达变化与多种肿瘤的发生发展密切相关。miR-422a属于miRNA中的一员，在多种癌细胞中呈现低表达状态，发挥抑癌作用［3-5］。然而，miR-422a在宫颈癌中的作用尚未明确。本研究旨在探讨miR-422a及其下游靶基因对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，为宫颈癌的早期诊断、精确靶向治疗和预后改善提供新思路和新方向。

1 材料与方法

1.1 材料人胚肾细胞HEK293T，宫颈癌细胞株HeLa、SiHa以及人正常宫颈细胞株H8 均购自中国科学院上海细胞库。miR-NC、miR-422a、mut miR-422a均购自上海吉玛基因股份有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；pcDNA购自苏州金唯智公司；miR-422a靶向激肽释放酶-4（KLK4）野生型 3′-UTR 由苏州金唯智合成并连接到pcDNA载体；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自美国Abcam公司；鼠源KLK4一抗、鼠源Tubulin一抗、羊抗鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；SYBR Green Ⅰ购自北京索莱宝科技有限公司；基质胶购自加拿大BD Biosciences 公司；总mRNA 逆转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司；PVDF 膜购自美国密理博公司；多功能酶标仪购自美国Bio-Tek 公司；电泳仪购自美国Bio-Rad 公司；实时荧光定量PCR（qPCR）仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa、SiHa、H8细胞分别接种于含10%胎牛血清的完全DMEM 培养基中，并置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，当细胞融合度达到70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化酶进行传代，细胞处于对数生长期时，提取细胞RNA。

1.2.2 qPCR 检测细胞 miR-422a 表达水平将 HeLa、SiHa、H8细胞分别接种于6孔板中（2×105个/mL），当细胞密度达到70%～80%时，检测miR-422a 表达水平。引物序列见表1。RNA 提取试剂盒提取总RNA。cDNA 逆转录采用TaqMan Reverse Transcription Reagents、200 ng 总 RNA 及 Oligo dT，严格按照试剂说明书操作。按照SYBR Green 试剂盒说明检测miR-422a 表达水平。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性 15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 个循环，以 U6 作为内参。2-ΔΔCt法计算miR-422a的相对表达水平。选取相对表达量最低的细胞系进行后续实验。

Tab.1 Sequence of primers表1 引物序列

1.2.3 细胞分组及转染将1.2.2 选出的细胞系分为blank组、miR-NC 组、miR-422a 组、mut miR-422a 组、miR-422a+pcDNA组、miR-422a+pcDNA-KLK4组，转染前1 d，将各组细胞接种于6 孔板中，当细胞密度达到70%～80%时，使用Lipofectamine 2000 对各组细胞分别进行转染，6 h 后更换为完全培养液，并继续培养48 h进行后续实验。

1.2.4 CCK-8 检测各组细胞增殖情况取转染48 h 后的blank 组、miR-NC 组、miR-422a 组、miR-422a+pcDNA 组、miR-422a+pcDNA-KLK4 组细胞，胰酶消化并分别以1×104个/孔接种于96孔板中，培养0、2、4、6 d，每个时间点设置6个平行孔，于每日相同的时间点，每孔分别加入10 μL/孔CCK-8试剂，在37 ℃、5%CO2孵育箱中避光培养1 h，应用酶标仪检测450 nm处各孔的光密度（OD）值，实验重复3次。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭迁移实验：收集转染后的 blank 组、miR-NC 组、miR-422a 组、miR-422a+pcDNA组、miR-422a+pcDNA-KLK4 组细胞，胰酶消化并离心，纯DMEM重悬细胞，调整细胞密度，取200 μL的重悬液（约含有5×104个细胞）加入小室的上层，小室下层加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，每组设有4个复孔，放入孵育箱中培养，分别于6 h 和12 h 取出小室，加入700 μL 多聚甲醛固定20 min，再用结晶紫染色15 min，清水冲洗多余的结晶紫，并用棉签轻轻擦掉小室内侧细胞，固定后自然晾干，置于光学显微镜下随机读取5 个视野，在倒置显微镜下计数染色细胞。侵袭实验：将保存于-20 ℃并已分装好的Matrigel 基质胶放置于冰盒中，4 ℃过夜解冻，用纯DMEM 稀释，稀释比例为1∶7；稀释后的100 μL基质胶加入上室，放入37 ℃、5%CO2孵育箱中3～4 h，使其凝固，其余步骤同迁移实验。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-422a 与KLK4 的结合使用TargetScan 软件（http://www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-422a 下游靶基因。为确定KLK4 mRNA 的3′UTR 是否为 miR-422a 的直接靶蛋白，将 KLK4 mRNA 的野生型全长3′UTR 序列，克隆至pcDNA 质粒构建野生型质粒，并命名pcDNA-KLK4。提前1 d将HEK293T细胞（1×105个细胞/孔）接种于24 孔板，放入细胞培养箱中培养，待细胞密度达到 80%，将 3 组质粒 miR-NC+pcDNA-KLK4、miR-422a+pcDNA-KLK4、mut miR-422a+pcDNA-KLK4 分别共转染HEK293T 细胞，培养 24 h 后，按照 Dual-Luciferase Reporter Assay System 说明书操作，检测荧光素酶相对活性。实验重复3次，取平均值。

1.2.7 Western blot 检测细胞KLK4 蛋白表达收集1.2.3 各组细胞，胰酶消化并提取各组细胞总蛋白，取10 μL 蛋白行10%的SDS-PAGE，PVDF 转膜，浸入5%的脱脂奶粉中封闭1 h，加入KLK4 抗体（1∶1 000 稀释），4 ℃过夜孵育，漂洗后，加入HRP标记羊抗鼠二抗（1∶10 000稀释），37 ℃孵育1 h，漂洗3 次后，加入ECL 化学发光试剂，显影，Image J 分析灰度值，计算各组KLK4蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法所有数据均采用SPSS 22.0 软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。不同时点多组间比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-422a 在细胞中的表达情况与正常宫颈细胞 H8（1.001±0.041）相比，宫颈癌细胞 SiHa 和HeLa 中miR-422a 的相对表达量分别为0.363±0.062、0.213±0.030，均显著下降（n=6，F=103.440，P＜0.01），后续实验选择miR-422a表达量最低的宫颈癌HeLa细胞进行。

2.2 miR-422a对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响与miR-NC 组和 blank 组比较，miR-422a 组 4、6 d 细胞OD450明显下降（P＜0.01），而 blank 组和miR-NC 组相比差异无统计学意义，见表2。

Tab.2 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-NC group and miR-422a group表2 Blank组、miR-NC组、miR-422a组细胞不同时间点OD450比较（n=6，）

＊＊P＜0.01；F组间=44.261，F时间=1 438.930，F交互=12.331，均 P＜0.01；a与blank组比较，b与miR-NC组比较，P＜0.05

组别blank组miR-NC组miR-422a组F OD450 0 d 0.37±0.02 0.41±0.03 0.38±0.03 1.149 2 d 0.66±0.06 0.73±0.03 0.64±0.03 1.881 4 d 0.97±0.05 0.98±0.02 0.86±0.06ab 4.861＊＊6 d 1.71±0.15 1.73±0.16 1.50±0.13ab 21.268＊＊

2.3 KLK4 过表达逆转miR-422a 过表达对宫颈癌HeLa 细胞增殖的影响与miR-422a+pcDNA 组相比，miR-422a+pcDNA-KLK4组4、6 d细胞OD450明显升高（P＜0.01），见表3。

Tab.3 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表3 Blank组、miR-422a+pcDNA组、miR-422a+pcDNAKLK4组细胞不同时间点OD450比较（n=6，）

＊＊P＜0.01；F组间=146.056，F时间=2 011.021，F交互=25.748，均P＜0.01；a与blank组比较，b与miR-422a+pcDNA组比较，P＜0.05

组别blank组miR-422a+pcDNA组miR-422a+pcDNAKLK4组F OD450 0 d 0.46±0.04 0.38±0.05 0.44±0.04 2 d 0.66±0.06 0.59±0.08 0.63±0.06 4 d 0.94±0.09 0.80±0.08a 0.97±0.08b 6 d 1.71±0.16 1.27±0.14a 1.62±0.15b 1.1981.25010.014＊＊49.105＊＊

2.4 miR-422a对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响与miR-NC和blank组相比，6、12 h miR-422a组迁移细胞数与侵袭细胞数均显著减少（P＜0.05）。而miR-NC 组和blank 对照组相比差异无统计学意义，见表4，图1、2。

Tab.4 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-NC group and miR-422a group表4 Blank组、miR-NC组、miR-422a组细胞迁移、侵袭情况比较（n=6，个/视野，）

＊＊P＜0.01，a与blank组比较，b与miR-NC组比较，P＜0.05

组别blank组miR-NC组miR-422a组F细胞迁移6 h 87.20±4.47 84.70±6.38 40.80±10.84ab 51.211＊＊12 h 164.80±3.61 174.60±6.35 90.90±8.72ab 84.462＊＊细胞侵袭6 h 55.50±4.40 54.50±3.60 25.80±6.51ab 37.253＊＊12 h 106.70±7.40 108.60±9.15 47.90±9.08ab 116.025＊＊

2.5 KLK4 过表达逆转miR-422a 过表达对宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响与miR-422a+pcDNA组相比，miR-422a+pcDNA-KLK4 组 6、12 h 迁移细胞数与侵袭细胞数均明显增多，见表5，图3、4。

2.6 双荧光素酶报告基因实验验证结果 TargetScan软件预测发现miR-422a与KLK4 3′UTR存在互补结合位点，见图 5。miR-NC+pcDNA-KLK4 组、miR-422a+pcDNA-KLK4 组、mut miR-422a+pcDNAKLK4 组共转染细胞荧光素酶相对活性分别为0.786±0.083、0.342±0.059 和 1.032±0.092，组间差异有统计学意义（F=12.848，n=6，P＜0.01）。其中miR-422a+pcDNA-KLK4 共转染细胞荧光素酶的相对活性较miR-NC+pcDNA-KLK4降低（P＜0.05），而mut miR-422a+pcDNA-KLK4 共转染细胞荧光素酶的相对活性较miR-422a+pcDNA-KLK4 上升（P＜0.05）。

Fig.1 Effects of miR-422a overexpression on the invasion of HeLa cells(×200)图1 miR-422a对HeLa细胞侵袭能力的影响（×200）

Fig.2 Effects of miR-422a overexpression on the migration of HeLa cells(×200)图2 miR-422a对HeLa细胞迁移能力的影响（×200）

Tab.5 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表5 Blank组、miR-422a+pcDNA组、miR-422a+pcDNA-KLK4组细胞迁移和侵袭情况比较（n=6，个/视野，）

＊＊P＜0.01，a与blank组比较，b与miR-422a+pcDNA组比较，P＜0.05

组别blank组miR-422a+pcDNA组miR-422a+pcDNA-KLK4组F细胞迁移细胞侵袭6 h 85.30±5.37 45.20±4.35a 74.30±8.94b 61.321＊＊12 h 130.40±10.18 85.7±7.35a 124.60±9.35b 90.526＊＊6 h 58.50±6.62 20.80±6.80a 44.50±8.41b 42.289＊＊12 h 98.70±6.66 43.90±6.35a 89.60±8.72b 83.244＊＊

2.7 miR-422a 对宫颈癌 HeLa 细胞中 KLK4 蛋白表达水平的影响与miR-NC 组（1.001±0.081）相比，miR-422a组中KLK4蛋白的表达水平降低为0.183±0.064；与 miR-422a 组相比，mut miR-422a 组中KLK4 蛋白的表达水平升高为1.104±0.306（n=6，F=12.848，P＜0.01），见图 6。与 miR-422a+pcDNA 组相比，miR-422a+pcDNA-KLK4组中KLK4蛋白的表达水平升高（0.463±0.237vs.0.881±0.189），差异有统计学意义（n=6，F=20.848，P＜0.01），见图7。

Fig.3 Overexpression of KLK4 reversed the inhibitory effect of miR-422a on HeLa cell invasion(×200)图3 过表达KLK4蛋白逆转miR-422a对HeLa细胞侵袭的抑制作用（×200）

Fig.4 Overexpression of KLK4 reversed the inhibitory effect of miR-422a on HeLa cell migration(×200)图4 过表达KLK4蛋白逆转miR-422a对HeLa细胞迁移的抑制作用（×200）

Fig.5 TargetScan software predicted the specific binding sites between miR-422a and KLK4图5 TargetScan软件预测miR-422a与KLK4的特异性结合位点

Fig.6 Effects of miR-422a on KLK4 protein expression图6 miR-422a对KLK4蛋白表达的影响

Fig.7 Expressions of KLK4 proteins in the 3 groups of cells图7 3组细胞中KLK4蛋白表达情况

3 讨论

miR-422a在多种肿瘤细胞中异常表达，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为。miR-422a 在乳腺癌细胞中表达水平降低，过表达miR-422a 能够抑制乳腺癌干细胞增殖和肿瘤的形成［6］。Zheng等［7］研究发现miR-422a在结直肠腺癌中低表达，过表达miR-422a 可抑制直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，与正常宫颈H8细胞相比，宫颈癌HeLa、SiHa细胞系中miR-422a同样呈现低表达，其中在宫颈癌HeLa 细胞中更明显，因此选择在宫颈癌HeLa 细胞验证其功能。本研究中，与blank和miR-NC组相比，miR-422a组细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显下降，提示miR-422a在宫颈癌的发生和发展过程中发挥了肿瘤抑制作用。

miRNA 主要通过与靶向蛋白基因的3′ UTR 互补匹配，从而抑制其靶基因表达。因此，探讨miR-422a 的靶向基因是了解miR-422a 在癌症中抑癌作用机制的关键。Zhu 等［8］研究发现，miR-422a 通过靶向CDC40 mRNA 3′ UTR，抑制胃癌细胞的增殖。在 Liu 等［9］研究中，miR-422a 通过靶向转化生长因子（TGF）-β2 的表达进而抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。在胶质瘤中，miR-422a通过靶向胰岛素样生长因子1（IGF1）和IGF1 受体（IGF1R）抑制细胞增殖、侵袭与迁移［10］。在肺癌细胞中miR-422a 通过靶向结合KLK4 mRNA的3′UTR进而抑制非小细胞肺癌的增殖［11］。本研究通过miRNA 靶基因数据库预测发现KLK4 基因与miR-422a 存在结合位点；采用双荧光素酶实验发现过表达miR-422a 能够降低KLK4 3′UTR野生型的荧光素酶活性。Western blot检测结果表明过表达miR-422a 能够靶向负调控KLK4蛋白的表达水平，这与Zhu等［11］的研究结果一致，进一步证实了KLK4 是miR-422a 的靶基因。KLK4 属于人组织激肽释放酶基因家族中丝氨酸蛋白酶，有关KLK 在组织和细胞中的分布以及生理（和病理生理）功能方面的研究已取得了进展［12］。研究发现KLK4参与了多种肿瘤的发生、发展，如在卵巢癌［13-14］、前列腺癌［15］、乳腺癌［16］、子宫内膜癌［17］、口腔鳞状细胞癌［18］中均呈现高表达状态，并且均与预后不良有关。本研究中，CCK-8、Transwell迁移和侵袭实验结果表明，过表达KLK4 蛋白能够逆转miR-422a过表达对宫颈癌HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。以上结果证实miR-422a 可以通过抑制KLK4的表达发挥抑癌作用。

综上所述，miR-422a在宫颈癌细胞系中低表达，过表达miR-422a 可通过下调KLK4 蛋白水平，抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究初步证实了miR-422a可能是治疗宫颈癌潜在的分子作用靶点，为宫颈癌发生发展分子机制的研究提供了理论基础。