BMP-9在胆道闭锁肝纤维化中的作用机制研究

葛亮 ，苟庆云，赵金凤 ，张聪，陈灵芝 ，胡晓丽 ，詹江华

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是婴儿期严重的肝胆系统疾病，以肝内、外胆管进行性炎症和纤维性梗阻为特征，继而导致胆汁淤积、肝纤维化和肝硬化。国内外研究表明进行性肝纤维化是影响肝门-空肠吻合术（Kasai 手术）预后的关键因素［1-3］。如何有效阻断肝纤维化进展是目前亟需解决的问题。研究表明转化生长因子β（TGF-β）/SMAD 信号通路在BA 肝纤维化中发挥了重要作用［4］。骨形态发生蛋白 9（bone morphogenetic protein 9，BMP-9）属 于TGF-β超家族成员，参与调节多种生物功能，包括铁离子平衡、软骨形成、血管生成、神经元分化及脂质代谢等。此外，研究表明BMP-9具有促进肝纤维化的作用［5］。但 BMP-9 在 BA 肝组织中的表达情况尚不明确。本研究检测了BMP-9 及其下游通路蛋白/基因在BA肝组织中的表达情况，并通过细胞实验探讨其促进纤维化进程的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 采用简单随机法抽取天津市儿童医院2018 年1 月—2019 年 1 月收治的 14 例 BA 患儿 Kasai 手术时肝组织标本为 BA 组，其中男 6 例，女 8 例，手术日龄 40～82 d，平均（67±11）d。BA 诊断标准：手术探查及术中胆道造影确诊为Ⅲ型胆道闭锁。简单随机法抽取同期5 例胆总管囊肿（congenital biliary dilatation，CBD）患儿手术时肝组织标本为CBD组，其中男2例，女3例，手术日龄287～752 d，平均（479±181）d。CBD 诊断标准：术前根据腹部超声及磁共振检查确诊。肝组织标本均取自术中肝右叶前缘组织，10%福尔马林溶液固定，用于HE、免疫组织化学染色；部分新鲜肝组织获取后放置无菌EP 管中，-80 ℃冰箱内保存，用于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）检测。LX-2 人肝星状细胞（341818）购自BNCC 公司。DMEM 高糖培养液购自江苏凯基生物技术股份有限公司；SYBR Green 购自北京全式金生物技术有限公司；NP-40 蛋白裂解液、PMSF 蛋白酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自天根生化科技有限公司；RNA 提取试剂盒购自Omega；逆转录试剂盒（B532435）购自生工生物工程有限公司；人重组BMP9（rBMP-9，3209-BP）购自R&D systems；人重组TGF-β1（r-TGF-β1）、兔抗人单克隆BMP-9 抗体（bs-6909R）、鼠抗人单克隆磷酸化SMAD1/5（p-SMAD1/5）抗体（bs-3418R）、DNA结合抑制因子1（inhibitor of DNA binding 1，ID1）抗体（bs-3529R）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）重组兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 聚合物均购自北京博奥森生物技术有限公司；SMAD1/5抗体购自 Cell Signaling Technologies；β-actin 抗体（A01010）购自Abbkine。普通光学显微镜购自Olympus公司；台式高速低温离心机购自Thermo 公司；LightCycler 96 qPCR 仪购自Roche公司；Tanon5200 全自动数码凝胶成像系统购自上海沪析实业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化程度评估 BA 组及CBD 组患儿HE 染色的病理切片由我院专业病理科医师在光学显微镜下进行肝纤维化分级，参照METAVIR分级标准［6］。0级：无纤维化；1级：汇管区纤维性扩大，无间隔；2级：汇管区纤维性扩大，少量间隔；3级：大量间隔伴结构紊乱，无肝硬化；4级：肝硬化。本研究将1级和2级定义为轻度肝纤维化；将3级和4级定义为重度肝纤维化。

1.2.2 免疫组织化学染色检测肝组织中BMP-9、p-SMAD1/5的表达情况 病理切片脱蜡至水，枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复15 min，冷却至室温，PBS 缓冲液冲洗5 min×3 次，于3%H2O237 ℃中孵育10 min，再用PBS冲洗5 min×3次，滴加一抗（BMP-9、p-SMAD1/5），于冰箱中4 ℃过夜，次日取出置于室温，PBS 洗 5 min×3 次，加二抗于 37 ℃下孵育 30 min，PBS 洗5 min×3 次，经DAB 显色5～10 min，镜下观察染色情况，充分水洗，苏木素液染核，脱水、透明、中性树胶封片，于低倍镜（×100）下观察染色（棕色）区域，高倍镜（×200）下辨别阳性细胞种类及表达情况。定性分析：根据染色强度分为无棕黄色（阴性）、淡棕黄色（弱阳性）、棕黄色（阳性）、棕褐色（强阳性）。半定量分析：每张切片阳性部位处取5个不同视野100倍显微镜下图片，经IPP（Image pro-plus）5.0 分析图片，计算BMP-9 及p-SMAD1/5 蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝组织阳性细胞光密度总和/阳性面积。

1.2.3 qPCR检测患儿肝组织中BMP-9 及ID1 mRNA的表达情况 经Trizol 法提取人肝组织总RNA，使用酶标仪检测总RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明，取500 ng RNA进行10 μL体系逆转录。将获得cDNA 稀释10 倍，用PCR 反应体系在Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪上得出Ct值。实验条件为：预变性95 ℃ 180 s；95 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40个循环；熔解95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。采用 2-ΔΔCt法计算每组样品中mRNA相对表达量。实验所用引物序列见表1。

Tab.1 Sequence of primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.4 LX-2 细胞培养及分组 将人肝星状细胞LX-2 置于37 ℃恒温，5%CO2条件下用DMEM 高糖培养液培养，加入10%胎牛血清、1%双抗（100 U/mL 青霉素/链霉素），0.3%胰酶消化传代。分组干预方法：（1）空白对照组（正常培养的LX-2 细胞）、BMP-9 组（加入100 μg/L rBMP-9）、TGF-β1 组（加入50 μg/L rTGF-β1）、BMP-9+TGF-β1 组（同时加入100 μg/L rBMP-9 及50 μg/L rTGF-β1）。（2）根据加入rBMP-9 含量不同分为0、10、50及100 μg/L组。

1.2.5 蛋白印迹法检测LX-2 细胞中SMAD1/5、p-SMAD1/5、ID1、α-SMA 蛋白表达情况 细胞加入适量RIPA 裂解液重悬，裂解液中含有1×Cock Tai（l蛋白酶抑制剂混合物），反复吹打几次混合均匀，在冰上静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上清于新的离心管中获得总蛋白。用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量提取总蛋白，细胞经1×loading buffer提取总蛋白。将获得的蛋白进行SDS-PAGE，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上（250 mA恒流90 min），封闭液孵育70 min，4 ℃一抗 α-SMA（1∶1 000）、ID1（1∶1 000）、SMAD1/5（1∶1 000）、p-SMAD1/5（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）孵育过夜，洗膜后37 ℃孵育二抗（1∶5 000）50 min，采用ECL化学发光法显色。通过数字图像处理系统获得Western blot图像。以β-actin为对照内参，目的蛋白/内参蛋白的灰度值作为蛋白的相对表达量。

1.2.6 qPCR 检测 LX-2 细胞中 α-SMA和 ID1 mRNA 的表达情况 经RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。严格按照试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪检测总RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明，取500 ng RNA进行10 μL体系逆转录。将获得 cDNA 稀释 10 倍，用 PCR 反应体系在 Light Cycler 96 qPCR仪上得出Ct 值。反应条件同1.2.3。实验所用引物序列见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件及Graphpad prism 8软件进行统计分析。计量资料数据以表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey 检验；细胞水平各项实验均重复3 次，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化程度评估结果 5例CBD患儿肝组织中镜下肝小叶结构存在，汇管区无增宽，胆管及纤维组织无增生，可见少量炎性细胞浸润，肝纤维化均为0级。14例BA患儿肝组织中可见汇管区增宽，胆管增生，纤维组织增生、桥接纤维化现象普遍，部分患儿可见假小叶形成，伴炎性细胞浸润，其中轻度肝纤维化8例，重度肝纤维化6例，见图1。

2.2 肝组织中BMP-9、p-SMAD1/5蛋白的表达情况

2.2.1 免疫组化定性分析 BMP-9、p-SMAD1/5 在CBD 患儿肝组织中肝细胞、汇管区胆管上皮细胞及血管内皮细胞呈弱阳性表达；在轻度肝纤维化BA患儿肝组织中肝细胞、胆管上皮细胞及血管内皮细胞呈阳性表达；在重度肝纤维化BA患儿中胆管上皮细胞、肝细胞及血管内皮细胞呈强阳性表达，见图2。

Fig.1 HE staining of liver tissue in CBD and BA groups(×40)图1 CBD、BA组肝组织HE染色情况（×40）

Fig.2 The expression of BMP-9 and p-SMAD1/5 in liver tissues(IHC,×200)图2 BMP-9、p-SMAD1/5在肝脏组织中的表达情况（免疫组化，×200）

2.2.2 免疫组化半定量分析 BA 组患儿肝组织中BMP-9 及 p-SMAD1/5 表 达水平 均 高于 CBD 组（BMP-9：0.154±0.028vs.0.120±0.016，t=2.555；p-SMAD1/5：0.151±0.017vs.0.129±0.018，t=2.317；均P＜0.05）。重度肝纤维化患儿BMP-9 的表达高于轻度肝纤维化患儿（0.172±0.026vs.0.141±0.023，t=2.335，P＜0.05）；而p-SMAD1/5 在轻度与重度肝纤维化患儿中的表达差异无统计学意义（0.154±0.019vs.0.148±0.017，t=0.573，P＞0.05）。

2.3 肝组织中BMP-9 及ID1 mRNA 表达水平 BA组 BMP-9 mRNA 表达水平高于 CBD 组（7.011±3.867vs. 1.000±0.370，t=3.282，P＜0.01）；重度肝纤维化患儿BMP-9 mRNA 表达高于轻度肝纤维化患儿（2.569±0.522vs. 1.000±0.480，t=7.379，P＜0.01）。BA 组 ID1 mRNA 表达高于 CBD 组（2.456±0.973vs.1.000±0.365，t=3.088，P＜0.01）；重度肝纤维化患儿ID1 mRNA 表达高于轻度肝纤维化患儿（1.759±0.442vs.1.000±0.298，t=3.547，P＜0.01）。

2.4 LX-2细胞α-SMA表达情况 BMP-9组、TGF-β1 组和 BMP-9+TGF-β1 组 LX-2 细胞中 α-SMA 蛋白表达均较空白对照组升高（n=3，F=544.100，P＜0.05），见图 3。BMP-9 组、TGF-β1 组和 BMP-9+TGF-β1 组 LX-2 细胞中 α-SMA mRNA 表达水平分别为 2.037±0.124、3.108±0.275 和 3.506±0.484 均较空白对照组（1.000±0.140）升高（n=3，F=29.450，P＜0.01）。

Fig.3 The expression of α-SMA after treatment with rBMP-9(and/or rTGF-β1)图3 rBMP-9和（或）rTGF-β1处理后细胞α-SMA表达情况

2.5 不同浓度rBMP-9干预后LX-2细胞SMAD/ID1信号通路蛋白和ID1、α-SMA mRNA 表达情况 将LX-2 细胞加入不同剂量rBMP-9 后，其下游信号蛋白 p-SMAD1/5、SMAD1/5、ID1 及 α-SMA 表达增多，ID1及α-SMA mRNA 表达水平增加（P＜0.05），见图4、表2。

Fig.4 The expression of proteins in SMAD/ID1 signaling pathway after treatment with different doses of rBMP-9图4 不同剂量rBMP-9处理后SMAD/ID1信号通路蛋白表达情况

Tab.2 Comparison of ID1 and α-SMA mRNA expression levels after treatment with different doses of rBMP-9 between five groups表2 不同剂量rBMP-9处理后各组ID1及α-SMA mRNA表达水平比较

3 讨论

BA肝纤维化进展迅速且不可逆，部分肝细胞和胆管上皮细胞发生上皮-间质转分化（EMT）以及肝星状细胞（HSC）被激活后转化为肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，促进肝纤维化发生发展。研究认为快速进展的肝纤维化与促纤维化通路密切相关，其中TGF-β1/SMAD 信号通路在BA 肝纤维化的发生发展过程中起到至关重要的作用［4］。BMP-9是从骨基质中提取的一组诱导异位软骨及骨形成的细胞因子，属于TGF-β 超家族成员，和TGF-β 信号通路中的配受体结合形式存在相似性。BMP-9 具有广泛的生物学作用，包括影响细胞的增殖、分化和凋亡，参与组织的再生和修复等［7-8］。BMP-9 主要表达于肝脏，在健康人体中呈低表达状态［9］。

3.1 BMP-9 参与BA 肝纤维化 本研究结果显示，相较于CBD 组，BA 组患儿肝组织中BMP-9 及p-SMAD1/5 蛋白，BMP-9 及 ID1 mRNA 表达均显著增加，而且在 BA 组中 BMP-9 蛋白、BMP-9 及 ID1 mRNA表达水平伴随着肝纤维化程度加重呈增高趋势。尽管p-SMAD1/5在BA 亚组间的表达无明显差异，但是在重度肝纤维化肝组织的汇管区p-SMAD1/5具有强阳性表达。由此可见，BA 患儿肝组织中BMP-9/SMAD/ID1 信号通路蛋白表达水平增加，且与肝纤维化轻重程度有关。BMP-9主要通过SMAD途径调节靶基因的转录和表达［10］。BMP-9 与Ⅰ型受体（ALK1、ALK2）和Ⅱ型受体（BMPR2、ActRⅡ）结合后，导致SMAD 1/5/8磷酸化，磷酸化的SMAD 1/5/8与SMAD 4 形成一个多聚肽复合物，并向细胞核迁移，与靶基因中的SMAD 反应元件结合并诱导基因表达。BMP-9在肝脏可表达于肝星状细胞，随着肝纤维化逐渐加重，BMP-9及其靶基因ID1表达增多，抑制BMP-9能够延缓肝纤维化进展［5］。作为BMP-9的靶基因，ID1 在HSC 向成纤维细胞的转化以及HSC的EMT中起重要作用［11］。HSC中ID1的缺失会影响α-SMA 的合成，表明ID1 在纤维化过程中起着至关重要的作用［12］。在肝纤维化过程中，BMP-9激活的ALK1 通过SMAD1 途径激活靶基因ID1，从而诱导HSC 分化为成纤维细胞，产生细胞外基质蛋白［13］。结合本研究结果及相关研究，BMP-9参与BA肝纤维化的进程，其可能具有促进BA肝纤维化的作用。

3.2 BMP-9通过SMAD1/5-ID1通路促进LX-2纤维化 本研究以rTGF-β1 处理LX-2 细胞后，α-SMA蛋白及mRNA表达含量较空白对照组明显升高。以rBMP-9 处理 LX-2 细胞后，α-SMA 蛋白及 mRNA 表达含量也较空白对照组明显升高。TGF-β1 是目前已知最强的促纤维化细胞因子之一［14］。TGF-β1/SMAD 通路在 BA 肝纤维化中起到了重要作用［15］。整合素蛋白ανβ6等因素激活TGF-β1配体，后者与受体结合诱导细胞内SMAD2/3 磷酸化，磷酸化的SMAD2/3 与SMAD4 形成络合物，并向细胞核移动，启动包括细胞外基质蛋白的基因转录，增加细胞外基质蛋白的表达，同时生成基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP-1）及纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1），抑制细胞外基质的降解［16-17］。本研究中TGF-β1 与BMP-9 表现出相似的功效，具有激活肝星状细胞、促进纤维组织增生的作用，以不同剂量的rBMP-9干预LX-2 细胞后，其下游通路p-SMAD1/5、ID1、α-SMA蛋白，及ID1、α-SMA mRNA在细胞中的表达均较0 μg/L 组升高。BMP-9 可通过激活经典的SMAD/ID1信号通路触发并激活肝星状细胞，从而调节肝纤维化的进展。Li等［18］通过腺病毒介导的基因敲低技术证实携带BMP9-shRNA 的腺病毒可以减轻小鼠的肝纤维化。本研究结果表明BMP-9 可通过磷酸化SMAD1/5 诱导肝星状细胞核内ID1 表达，导致细胞外基质α-SMA表达增高，促进纤维化进程。

综上所述，在BA 患儿肝组织中BMP-9、p-SMAD1/5、ID1 表达水平较 CBD 患儿增加，且与肝纤维化程度有关。BA 患儿肝组织及细胞实验结果提示BMP-9 可以通过SMAD/ID1 信号通路促进BA 肝纤维化进程。持续性肝纤维化是影响BA 患儿预后的关键因素，抑制BMP-9可能作为一个潜在的治疗靶点，在一定程度上提高抗肝纤维化药物的治疗效果，从而延长BA患儿的自体肝生存时间。