先天性巨结肠患儿不同肠管中SOX-2、SOX-10、GDNF的表达及其临床意义*

庞文帅，马建苏，刘晓丽，周丽霞，王博，王淼

（邢台市人民医院，河北 刑台054031）

先天性巨结肠，又称希尔施普龙病（hirschsprungs disease,HD）是新生儿常见的先天性发育停顿疾病，发病率约为1/5 000，男性发病率高于女性，为4∶1[1]。病理变化主要是直肠、结肠神经节细胞缺如，表现为新生儿出生后胎粪排出延迟、腹胀、结肠炎、低位性肠梗阻等，不仅影响患儿的生长发育，严重时还会危及患儿生命[2]。近年来流行病学调查显示，HD 的发病率呈上升趋势[3]，因此研究HD 的病因及机制对优生优育十分重要。目前HD 的病因和机制虽然尚未完全阐明，但随着分子生物学技术的发展，现有的研究已明确显示，HD 的发生与SOX-2、SOX-10、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived meurotrophic factor,GDNF）密切相关[4-5]。本研究运用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SOX-2、SOX-10、GDNF 在HD 患儿狭窄段、扩张段、移行段肠管组织及非HD 患儿结肠中的表达情况，旨在阐明其在HD 中的作用，进一步探讨HD 在分子基础上的发病机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月—2019年8月邢台市人民医院手术治疗的HD 患儿85 例作为HD 组，其中，男性71 例，女性14 例，年龄2 个月～7 岁，平均（3.7±0.6）岁。患儿术后均经病理组织学检查确诊为HD。其中，常见型62 例，短段型23 例；患儿均无HD家族史，均为散发性，均未合并其他器官先天性畸形。取HD 患儿切除的狭窄段、扩张段、移行段组织作为HD 各肠段组，同期选取行结肠造瘘术的患儿20 例作为对照组，其中，男性16 例，女性4 例，年龄4 个月～6 岁，平均（3.9±0.7）岁，分别为先天性直肠肛管畸形16 例，肛门直肠损伤4 例。两组患儿年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 显微观察及测量取HE 染色切片，观察对照组、HD 组狭窄段、HD 组扩张段、HD 组移行段肌间神经节细胞数目，用显微测量软件测量肠肌间神经丛直径、神经节细胞直径、神经节细胞质/核，每张切片随机采集3 个400 倍视野，录入Excel 表格，计算各组平均值。

1.2.2 qRT-PCR取全层肠壁组织，弃去黏膜，用无菌生理盐水冲洗后置于Ep 管中，于-80℃冰箱中保存。提取总RNA：检测时取肠组织200 mg，加入1 ml Trizol 后置于冰水上的匀浆器中研磨，按说明书步骤提取总RNA。引物设计：采用Primer 5.0设计，SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列见表1。

表1 SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列

1.2.3 逆转录合成cDNA按Fermentas RT-PCR 试剂盒说明书操作步骤操作，对提取的mRNA 进行逆转录，反应体系为RNA 模版2 μl，Oligo（dT）1 μl，逆转录酶1 μl，5×Buffer 5 PL，dNTP 2 μl，Ribalock抑制剂1 μl，RNase free H2O 调整总体积至20 μl，GDNF 反应条件为70℃预变性5 min，37℃变性5 min，42℃退火60 min，70℃延伸10 min，共32 个循环。SOX-2、SOX-10 反应条件为65℃预变性5 min，42℃变性60 min，70℃退火10 min，共45 个循环。PCR 检测：引物通过GenBank 查找SOX-2、SOX-10、GDNF 的mRNA 序列，计算机自动输出每个cDNA 模版标本的扩增曲线、CT 值和拷贝数。

1.3 观察指标

比较对照组、HD 组狭窄段、HD 组扩张段和HD 组移行段肌间神经节细胞数、肌间神经丛直径、神经节细胞直径、神经节细胞质/核；比较对照组、HD 组狭窄段、HD 组扩张段和HD 组移行段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 的相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠肌间神经丛直径等相关指标比较

各组肌间神经丛直径、神经节细胞直径、神经节细胞数、神经节细胞质/核比较，经方差分析，差异有统计学意义（均P＜0.05）。其中，肠肌间神经丛直径：HD 组狭窄段＜HD 组移行段＜HD 组扩张段和对照组；神经节细胞直径、神经节细胞数、神经节细胞质/核比：HD 组移行段＜HD 组扩张段和对照组。见表2。

表2 对照组与HD组各肠段肌间神经丛直径，神经节细胞数、直径、质/核情况 （±s）

表2 对照组与HD组各肠段肌间神经丛直径，神经节细胞数、直径、质/核情况 （±s）

注：HD组狭窄段神经节细胞缺如。①与对照组比较，P ＜0.05；②与HD组扩张段比较，P ＜0.05。

组别对照组HD组扩张段HD组移行段HD组狭窄段F 值P 值n 20 85 85 85肌间神经丛直径/μm 58.67±11.72 57.13±10.86 34.28±7.63①②30.59±6.24 11.073 0.000神经节细胞数/个5.72±1.16 5.62±1.24 1.86±0.32①②-24.637 0.000神经节细胞直径/μm 16.57±3.61 16.02±3.52 11.82±2.76①②-19.286 0.000神经节细胞质/核2.33±0.43 2.20±0.51 1.60±0.33①②-29.763 0.000

2.2 各组SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相对表达量比较

各组SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步两两比较，HD 组狭窄段＜HD 组移行段＜HD 组扩张段和对照组（P＜0.05）。对照组与HD组扩张段比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 对照组与HD组各肠段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相对表达量比较 （±s）

表3 对照组与HD组各肠段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相对表达量比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与HD组扩张段比较，P ＜0.05；③与HD组移行段比较，P ＜0.05。

组别对照组HD组扩张段HD组移行段HD组狭窄段F 值P 值n 20 85 85 85 SOX-2 mRNA 33.69±7.85 32.84±6.29 31.13±7.05①②30.04±5.42①②③9.672 0.000 SOX-10 mRNA 1.34±0.28 1.33±0.36 1.30±0.34①②1.08±0.26①②③8.054 0.000 GDNF mRNA 1.31±0.21 1.19±0.18 0.89±0.13①②0.68±0.11①②③11.072 0.000

3 讨论

HD 是常见的先天性畸形之一,有研究显示，HD 的病因与肠神经嵴细胞迁移形成肠神经系统（enteric nervous system,ENS）的过程异常有关[6-8]。ENS 由致密的神经纤维将特殊的胶质细胞和神经节细胞相互连接,组成一个独立完整的调节系统，对肠道的血液循环、蠕动、吸收等进行调节[9]。本研究运用显微测量的方法测量对照组，HD 组狭窄段、扩张段和移行段肌间神经节细胞数、肌间神经丛直径、神经节细胞直径、神经节细胞质/核，结果显示，肠肌间神经丛直径：HD 组狭窄段＜HD组移行段＜HD 组扩张段和对照组；神经节细胞直径、神经节细胞数、神经节细胞质/核：HD 组移行段＜HD 组扩张段和对照组。说明HD 患儿部分肠段神经节细胞缺如，导致神经系统发育停顿,但原因迄今未明。

Dom SOX-10是杂合子动物中唯一被认识的产生致死性ENS 表型的突变基因，其可改变正常读码框，导致一种截断的蛋白产物[10-11]。近年来动物实验研究证实，在显性巨结肠突变大鼠中SOX-10基因缺乏，导致ENS 发育停顿，可能是神经嵴细胞突变后在移行早期过量死亡所致[12-14]。由此可见SOX-10基因可能参与肠神经元的发育。本研究结果显示，各组SOX-10 mRNA 相对表达量有差异。其中HD 组狭窄段SOX-10 mRNA 相对表达量低于HD 组移行段；HD 组狭窄段和移行段均低于HD 组扩张段和对照组。对照组、HD 组扩张段SOX-10 mRNA 的相对表达量无差异。说明SOX-10 mRNA在病变肠段中表达逐渐减少，特别是在无神经节细胞的狭窄肠段中表达减少得更加明显，分析原因由于狭窄肠管内缺乏正常表达SOX-10 mRNA 的肌间神经节细胞，可能在HD 患儿肠管狭窄段中存在能被SOX-10 处理的乙酞胆碱醋酶受体或神经营养因子，从而刺激无神经节细胞肠管中的其他兴奋性神经纤维生长，致神经纤维异常增生引起肠管狭窄痉挛和肠功能障碍[15-17]。同时也说明SOX-10可能是维持肠神经功能的重要基因。

SOX-2 分子量约为35 kD，是多潜能性干细胞标志物，其转录激活区域为C 末端，包含一段富含核苷酸的序列，SOX-2与SOX-10一样，均为SOX基因家族成员。近年来研究发现，不仅在生殖细胞、胚胎干细胞中表达，而且在正常肠道神经嵴细胞、胶质细胞衍生物中均广泛表达[18-20]，并参与广泛的发育调节。本研究结果显示，SOX-2 mRNA相对表达量为狭窄段＜移行段＜扩张段。原因可能为SOX-2 呈低表达时，不能很好地发挥发育调节作用，所以导致肠管狭窄。GDNF 是转化生长因子（TGF）2B 超家族的新亚族，是REX 的配基之一[21-23]。既往研究认为GDNF 的突变不足以引发HD，但近年来研究发现，REX 基因突变是HD 众多基因突变之一[18]。GDNF 对胃肠道、中枢神经系统、周围自主神经、感觉神经等多种神经元均有营养和保护作用，与多种神经元的分化和生存支持有关[24]。胡晓丽等[25]应用免疫组织化学染色检测HD 患儿狭窄段、移行段和扩张段GDNF 分布，结果显示狭窄段GDNF 分布明显少于移行段和扩张段。本研究从转录水平研究HD 患儿不同肠段GDNF mRNA 的表达，结果显示，狭窄段＜移行段＜扩张段。与胡晓丽等结果基本相符，提示SOX-2、GDNF、SOX-10 可能参与了ENS 发育。

综上所述，HD 的发生可能与多种基因一起导致病变肠段SOX-2、SOX-10等基因突变后，SOX-2、SOX-10、GDNF 表达减少有关。本研究结果显示，HD患儿病变肠管组织SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相对表达量扩张段、移行段、狭窄段逐渐降低，说明SOX-2、SOX-10、GDNF可能是维持肠神经系统功能正常的必要基因，如果上述基因表达降低，则可能引起肠管狭窄出现功能障碍，但上述基因在HD 发生中的作用尚有待进一步研究。