阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠结肠形态及盲肠内容物短链脂肪酸影响

朱明睿，于晨晨，徐艳丽，张 莉，孙佳宁，邓香娟，王子荣

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

我国属于羊肉消费大国，新疆作为羊肉生产和消费大省，2018年绵羊出栏数高达3677.8万只[1]。新疆肉羊以脂臀羊居多，该品种肉质较好且臀部脂肪含量非常高[2]。阿勒泰羊作为新疆地区优质的脂臀羊品种之一，其脂肪沉积丰富，尾臀部脂肪可占胴体重量的20%[3]。已有研究人员对羊臀脂某些营养特性进行了初步研究，李涛等[4]和刘丹等[5]发现阿勒泰羊臀脂和哈萨克羊臀脂都符合人类健康性食用的标准，何鑫等[6]发现阿勒泰羊臀脂中不饱和脂肪酸占比49.30%。由此可见，羊臀脂营养价值较高，但目前相关研究较少，针对羊臀脂营养特性有待于开展更深入的研究。

溶剂法分提能改变油脂中脂肪酸的组成，得到营养价值不同的油脂[7]。张晓鹏等[8]将猪油经过溶剂法分提后，得到了富含结构脂的液脂，并以此为原料开发人乳替代脂肪。沈继红等[9]通过溶剂分提技术分离了鱼油中高凝固点组分，结果表明该法能有效提高鱼油中液态油脂含量，并且提高分提产物中多不饱和脂肪酸含量。因此，研究油脂分提产物的营养特性能够为后续功能性油脂的开发利用提供理论基础。

前人研究发现，膳食脂肪的摄入会对宿主体内肠道菌群及其代谢产物（如短链脂肪酸，short-chain fatty acids，SCFAs）产生影响[10−11]，进而影响宿主健康。SCFAs可以直接为肠黏膜细胞提供能量、调节肠道免疫、维持肠道的正常生理功能[12]，此外SCFAs在肠粘膜在自我修复和保持肠上皮细胞的紧密连接及完整性方面具有重要作用[13]。肠内SCFAs的种类和浓度会因为食物和肠道微生态菌群的不同而有所差异[14]。因此SCFAs的含量可以一定程度上反映肠道菌群和肠道健康的状况。研究发现，SCFAs在盲肠和结肠中含量最高[15]，但由于近端结肠中SCFAs含量远高于远端结肠，因此盲肠中SCFAs成分及含量常作为法分析肠道菌群代谢的重要指标[16]。Caesar等[17]研究中发现，高脂饮食对肠道微生物区系的多样性产生不同的影响，进而导致肠内SCFAs的差异。Schwiertz等[18]研究了高脂诱导小鼠肥胖对其肠道短链脂肪酸的影响，与正常饮食小鼠相比，肥胖小鼠肠道中短链脂肪酸水平明显下调。Wan等[19]研究了低脂、中脂和高脂摄入对人体肠道菌群代谢产物的影响，发现高脂组肠道短链脂肪酸出现显著下降。油脂摄入对于肠道中短链脂肪酸水平的影响也是近年来的研究热点。

许多肠道疾病如肠炎、结肠癌等，最常发于结肠[20]，所以结肠形态的观察对于肠道健康的研究有重要的意义。故本试验旨在通过动物实验，初步研究食用羊臀脂及其分提产物对小鼠肠道SCFAs及结肠形态的影响，为羊臀脂及其分提产物的食用健康性的研究提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级昆明雄性小鼠 共60只，18~20 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，饲养于新疆农业大学动物饲养室（SPF级），温度维持在24 ℃左右，保持每日12 h光照，湿度50%~60%，实验动物通过新疆农业大学实验动物福利委员会批准，批准编号：2019019；阿勒泰羊臀脂（10月龄） 新疆乌鲁木齐市米东区新华凌市场；乙酸标准品、丙酸标准品、丁酸标准品、正戊酸标准品、异戊酸标准品 纯度99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈 纯度99.9%，上海默克化工有限公司；磷酸二氢钠 分析纯，天津致远化学试剂有限公司；磷酸 分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛 分析纯，山东嘉颖化工科技有限公司；浓盐酸 分析纯，上海氯碱化工股份有限公司。

DZF-6050LC真空干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；DL-3010低温冷却液循环泵 上海市百典仪器厂；3H16RI型冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；SPD-20A紫外检测器（液相色谱仪）、LC-20AB高压恒流泵（液相色谱仪）、CTO-10AS恒温柱温箱（液相色谱仪） 岛津公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（25 cm×4.6 mm，5 μm）安捷伦科技（中国）有限公司；UPHW-III-90T超纯水机 北京杜伯特科技有限公司；LE204E/02万分之一天平 上海鑫仓电子科技有限公司；HS-S型组织切片机 沈阳恒松科技有限公司；HRS-22D高清恒染染色机 武汉汉谷医疗科技有限公司；moticBA300显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 阿勒泰羊臀脂分提 原脂的制备：采用何鑫等[6]的方法进行制备，选取新宰杀的阿勒泰羊臀脂，利用真空干燥箱（70 ℃，压力0.08 MPa，4 h）将阿勒泰脂臀羊臀脂粗提得到原脂，阿勒泰脂臀羊臀脂分提产物的制备：参照李涛等[4]的溶剂法分提并加以优化：羊臀脂原脂与丙酮按1:6（v/v）混合，利用配有温度设置程序的循环泵，设置起始温度为32 ℃，保持16 h，使其充分结晶，结晶结束后真空抽滤分离得到固脂，剩余液脂迅速降温至22 ℃，维持16 h使其充分结晶，结晶结束后真空抽滤分离得到固脂，12、2 ℃温度处理同上，得到熔点不同的组分：32 ℃分提羊臀脂、22 ℃分提羊臀脂、12 ℃分提羊臀脂、2 ℃分提羊臀脂，于真空干燥箱中挥发残余丙酮后，密封后−4 ℃冷藏备用。

1.2.2 试验油脂灌胃前处理 室温下，原脂、12、2 ℃分提产物呈固态，故参照GB/T 12766-2008中方法对原脂、12和2 ℃分提产物的熔点进行测定，熔点分别为（39.46±0.75）、（39.50±0.62）、（25.30±0.65）℃。灌胃前依次根据熔点温度恒温水浴加热（1~2 min）至液态，直接进行灌胃。

1.2.3 供试动物分组及灌胃剂量 参照我国部分城市5%~10%居民日烹调油日摄入量95 g[21]，折算为试验灌胃剂量1.5 mL/10 g。

选取小鼠60只，预饲养1周后，随机分为5组，每组12只，分为2 ℃分提产物组、12 ℃分提产物组、原脂（BF）组、菜籽油（RO）组和空白（CK）组，各组分别用相应油脂灌胃，CK组灌胃生理盐水。饲养过程中不限制饮食和饮水，每3 d称重并调整灌胃剂量。分别于第20、40 d禁食12 h，不禁水，称重，断颈处死（每次每组处死6只），测量相关指标。

1.2.4 小鼠结肠与盲肠内容物的采集 结肠采集：小鼠断颈处死后，于无菌操作台上取出结肠内容物后，将结肠利用生理盐水冲洗干净，浸泡于10%甲醛溶液中固定48 h，梯度脱水，浸蜡包埋，采用H&E染色法染色，置数码显微镜下进行病理学观察。

盲肠内容物的采集：小鼠断颈处死后，于无菌操作台上取盲肠内容物，迅速装入EP管中冻存于液氮中待测。

盲肠内容物的处理：取50 mg冻存的盲肠内容物，按100 mg/mL加入2 mmol/L的HCl，于样品制备机震荡60 s后，静置25 min，于4 ℃、12000 r/min离心30 min，吸取上清液，过0.22 μm水系滤膜后进样检测。

1.2.5 盲肠内容物检测

1.2.5.1 液相色谱条件 参照陈和地等[22]和Faujan等[23]的方法，并加以优化。流动相比例为乙腈:水=14:86（v/v，含25 mmol/ L磷酸二氢钾溶液缓冲液，pH=2.3），流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温45 ℃，进样量20 μL。

1.2.5.2 标准曲线绘制 采用外标法定量，以目标短链脂肪酸的峰面积为纵坐标（y），以质量浓度为横坐标（x），进行标准曲线绘制，如表1所示。

表1 短链脂肪酸标准曲线方程Table 1 Short-chain fatty acid standard curve equation

1.3 数据处理

采用Excel 2007统计并整理数据，利用Origin9.0软件作图，运用SPSS19.0（Duncan法）分析数据差异性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠盲肠内容物总短链脂肪酸含量的变化

短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸等，他们是肠道细菌发酵膳食纤维和碳水化合物的产物，是肠腔内最丰富的微生物代谢产物之一[24]。由图1可见，经20 d喂养，各组小鼠盲肠内容物总短链脂肪酸含量为：CK组>12 ℃组>BF组>2 ℃组>RO组，其中各油脂处理组均显著低于CK组（P<0.05），RO组显著低于12 ℃分提组（P<0.05）。40 d喂养后，各组盲肠内容物总短链脂肪酸含量均有所下降，各组盲肠内容物总短链脂肪酸含量为：CK组>12 ℃组>2 ℃组>BF组>RO组，且2 ℃组和12 ℃组分别显著高于RO组44.34%和63.69%（P<0.05）。

图1 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物总短链脂肪酸含量的影响Fig.1 Effects of Altay sheep buttock fat and its extract on the content of total short chain fatty acids in cecum of mice

2.2 小鼠盲肠内容物乙酸含量的变化

乙酸能调节肠道内环境的pH，从而抑制有害菌的生长繁殖，有助于维持肠道健康[25]，此外，它是胆固醇合成的底物[26]，也是通过中央下丘脑机制抑制食欲的重要物质[27]。由图2可见，经20 d喂养，各组小鼠盲肠内容物乙酸含量为：CK组>12 ℃组>BF组>2 ℃组>RO组，各油脂处理组间无显著性差异，且显著低于CK组（P<0.05）。40 d喂养后，各组盲肠内容物乙酸含量均有所下降，各组盲肠内容物乙酸含量为：CK组>12 ℃组>2 ℃组>BF组>RO组，且2 ℃组和12 ℃组分别显著高于RO组41.46%和64.87%（P<0.05）。在本试验中，40 d相较于20 d小鼠其盲肠中乙酸的含量下降，而2、12 ℃、BF和RO组分别降低了11.9%、3.49%、31.70%、31.66%，其中2 ℃组、12 ℃组相较于BF和RO组乙酸含量降低更为平缓，说明分提后的油脂更有利于维持肠道乙酸含量的相对稳定。任燕[28]研究发现，高脂饮食SD大鼠粪便中乙酸的含量要低于标准饮食组，Grant等[29]的研究也发现，高脂低碳水化合物的饮食摄入会对粪便中的SCFAs产生不利影响，这与本试验结果相似。

图2 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物乙酸含量的影响Fig.2 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of acetic acid in the cecum of mice

2.3 小鼠盲肠内容物丙酸含量的变化

丙酸在人体内作为脂肪酸生产的抑制剂，也在肠道中作为一种低级别的消炎剂[30]。此外，丙酸是肝脏蛋白质合成、糖异生和脂异生的前体[31]，它可以通过FFA2受体（也称为GPCR43）诱导脂肪的形成[32]。由图3可见，经20 d喂养，小鼠盲肠内容物中丙酸含量为：CK组>BF组>12 ℃组>2 ℃组>RO组，其中RO组显著低于BF组（P<0.05）。40 d喂养后，各油脂灌胃组丙酸含量均有所下降，小鼠盲肠内容物中丙酸含量为：CK组>12 ℃组>2 ℃组>BF组>RO组，且2和12 ℃组分别显著高于RO组55.23%和79.07%（P<0.05）。说明长期油脂的摄入会降低小鼠盲肠丙酸的含量，40 d饲养结束后2、12 ℃、BF和RO组相较于20 d饲养结束时，分别降低了10.58%、1.67%、33.29%、27.11%，其中2 ℃分提产物和12 ℃分提产物组丙酸含量降低更为平缓。吴水芸[33]研究发现，高脂摄入的情况下，小鼠肠道粪便丙酸含量有一定程度的下调，李贺[34]研究观察到，猪油组和大豆油组大鼠盲肠。短链脂肪酸含量低于空白组，这与本试验结果一致。

图3 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物丙酸含量的影响Fig.3 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of propionic acid in the cecum of mice

2.4 小鼠盲肠内容物丁酸含量的变化

丁酸是厚壁菌门的主要代谢产物，能被结肠上皮细胞吸收利用，是结肠、盲肠能量的首选来源[35]，也是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，它可以通过调节基因表达决定细胞命运[36]。由图4可见，经20 d喂养，小鼠盲肠内容物中丁酸含量为：CK组>2 ℃组>12 ℃组>BF组>RO组，各灌胃油脂组间不存在显著性差异（P>0.05）。40 d喂养后，小鼠盲肠内容物中丁酸含量为：CK组>12 ℃组>2 ℃组>BF组>RO组，各灌胃油脂组盲肠丁酸含量相较于20 d均有所降低，2和12 ℃组分别显著高于RO组48.41%和58.67%（P<0.05）。与20 d相比，喂养40 d后，各油脂灌胃组的丁酸浓度出现下降现象，2、12 ℃、BF和RO组分别降低了18.70%、11.95%、19.72%、20.65%。Greta等[37]的研究也发现了高脂肪饮食会减少了丁酸盐的形成。Kong等[38]发现，高糖和高脂饮食的摄入会降低微生物多样性和有益生菌的丰度，如丁酸产生菌的丰度，从而导致丁酸含量降低，这可能是本试验中随着喂养时间延长丁酸含量下降的原因。

图4 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物丁酸含量的影响Fig.4 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of butyric acid in the cecum of mice

2.5 小鼠盲肠内容物异戊酸含量的变化

由图5可见，经过20 d的喂养，小鼠盲肠内容物中异戊酸含量为：CK组>2 ℃组>12 ℃组>BF组>RO组，2和12 ℃组分别显著高于RO组116.97%、68.89%（P<0.05）。40 d喂养后，小鼠盲肠中异戊酸含量为：CK组>2 ℃组>12 ℃组>BF组>RO组，2 ℃组显著高于RO组83.88%（P<0.05），各灌胃油脂组盲肠异戊酸含量相较于20 d均有所降低。2、12 ℃、BF和RO组，其异戊酸含量在40 d饲养结束后相较于20 d分别降低了22.60%、16.60%、20.67%、8.67%，RO组相较于其他油脂摄入组，降低幅度较小。Ye等[39]也发现与本研究类似的结果，高脂摄入后空白小鼠结肠内容物异戊酸含量显著高于各油脂摄入组。

图5 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物异戊酸含量的影响Fig.5 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on isovaleric acid content in the cecum of mice

2.6 小鼠盲肠内容物戊酸含量的变化

由图6可知，经20 d喂养，小鼠盲肠内容物中戊酸的含量为：CK组>RO组>2 ℃组>12 ℃组>BF组，CK组显著高于其余各组（P<0.05），各灌胃油脂组盲肠中戊酸含量无显著性差异（P>0.05）。40 d喂养后，小鼠盲肠内容物中戊酸含量为：CK组>2 ℃组>12 ℃组>RO组>BF组，各灌胃油脂组盲肠内容物戊酸含量无显著性差异（P>0.05），但各灌胃油脂组盲肠异戊酸含量相较于20 d均有所降低。在本试验中，2、12 ℃、BF和RO组，其戊酸含量40 d饲养结束后相较于20 d分别降低了5.69%、19.01%、4.95%、23.12%。黄玉军等[40]研究发现高脂饮食会引起大鼠粪便中的戊酸含量下降，Ji等[41]的研究发现，高脂饮食组的戊酸含量低于空白对照组，这与本试验结果一致。

图6 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠盲肠内容物戊酸含量的影响Fig.6 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of valeric acid in the cecum of mice

2.7 羊臀脂及其分提产物对小鼠结肠形态学的影响

高脂饮食不仅可以诱导肠道微生物区系产生的SCFAs发生改变，而且还可能导致结肠损伤[42]。结肠绒毛的长度和隐窝深度，是影响肠道健康和生长性能的重要指标[43]。因此，研究了阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠结肠隐窝深度、绒毛高度和组织形态的影响。如图7所示，20 d饲养结束后，CK组小鼠结肠隐窝深度均显著高于2 、12 ℃、BF和RO组（P<0.05），12 ℃和BF组的隐窝深度分别显著低于RO组11.26%、18.96%（P<0.05），40 d饲养结束后，CK组小鼠结肠隐窝深度均显著高于2 、12 ℃和BF组（P<0.05），2、12 ℃和BF组隐窝深度分别显著低于RO组14.28%、16.22%和15.88%（P<0.05）。由图8可知，20 d饲养结束后，CK组小鼠结肠绒毛长度均显著高于2 、12 ℃、BF和RO组（P<0.05），12 ℃和BF组的绒毛长度分别显著低于RO组8.04%、16.19%（P<0.05）。40 d饲养结束后，2 、12 ℃和BF组之间结肠绒毛长度存在显著性差异（P<0.05），且12 ℃和BF组分别显著低于RO组6.09%和15.70%（P<0.05）。如图9所示，各油脂灌胃组和CK组相比，结肠绒毛中空腔较多，可能会干扰肠绒毛对机体必需营养物质的吸收。如图10所示，12 ℃和BF组小鼠结肠组织损伤要高于2 ℃和RO组，与20 d结肠形态相比，结肠绒毛长度下降，且空腔增多。这些结果表明，长期高脂摄入阿勒泰羊臀脂分提产物导致结肠组织的损伤的概率要低于菜籽油和羊臀脂原脂。叶展[44]研究发现棕榈油和猪油组的结肠绒毛长度和隐窝深度均低于对照组，通过结肠H&E切片可看到清晰的结肠绒毛结构和肠绒毛的刷状边缘，棕榈油和猪油组结肠绒毛的底部出现了初步的损伤状态。这与本研究中的结果相类似。

图7 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠结肠隐窝深度的影响Fig.7 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the depth of colonic crypts in mice

图8 阿勒泰羊臀脂及其分提产物对小鼠结肠绒毛长度的影响Fig.8 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the length of mouse colon villus

图9 20 d饲养小鼠结肠形态学观察Fig.9 Morphological observation of the colon of mice fed for 20 days

图10 40 d饲养小鼠结肠形态学观察Fig.10 Morphological observation of the colon of mice fed for 40 days

3 结论

在95 g每日的摄入水平下，研究羊臀脂原脂、菜籽油和阿勒泰羊臀脂分提产物对小鼠盲肠短链脂肪酸含量和结肠形态的影响。与原脂和菜籽油相比，阿勒泰羊2 ℃分提产物更有利于维持盲肠内容物SCFAs含量的相对稳定。2 ℃分提产物的结肠隐窝深度和绒毛长度大于其他各组，观察结肠H&E切片发现2 ℃分提产物对于结肠的损伤小于原脂和12 ℃分提产物。这说明阿勒羊臀脂在分提后其营养特性有所增强。研究结果可以为阿勒泰羊臀脂及其分提产物对肠道环境的影响提供一定理论支撑，启示还可以进一步的深入研究其对肠道微生物组成的影响。