一步式QuEChERS方法结合高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中25种磺胺类药物残留

谢瑜杰，李铁梅，牛相涛，张艳侠，扈 斌，吴兴强，范春林，陈 辉,

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250101）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是一类含有磺胺酰胺化学结构的药物，由于该类药物疗效好、价格低，且具有良好的抗菌作用，已被广泛用作细菌感染性疾病的预防和治疗剂[1−4]。除此之外，磺胺类药物也被当作饲料添加剂使用，对犊牛和猪进行增肥[5]，同时也可广泛用于动物育种，治愈动物疾病并提高其抗菌能力。磺胺类药物的大量使用造成其在肉类产品中广泛残留。

肉类作为当前消费者获取蛋白的主要来源，质量安全也越来越受重视。磺胺类药物多用于治疗细菌感染，其使用量对动物而言接近中等毒性，因此，磺胺类药物在动物体内的残留水平通常较高[6]。虽然磺胺类药物通过乙酰化后不会在人体内积聚，但是，滥用磺酰胺会诱使各种细菌产生对药物的强烈耐药性，极大地危害人体健康[5−7]。因此，建立一种快速检测磺胺类药物的方法尤为重要。

目前磺胺类药物残留主要检测方法有HPLC[8−9]、HPLC-MS/MS[10−12]、HPLC-Q-TOF-MS[13]和HPLCQ-Orbitrap[14]等技术。高效液相色谱-串联质谱法因其高灵敏度、高选择性及定量定性准确等特性，成为目前兽药残留应用最普遍的检测技术[11,15−16]。而针对畜禽肉的前处理方法，常见的净化方式有固相萃取柱净化[7,17]、液液萃取[18]和QuEChERS方法[19−20]。QuEChERS方法是当前主流前处理方法，主要应用于简单基质，而对于动物性复杂基质很少使用。有文献报道QuEChERS可用于鱼肉、猪肉等动物性食品的净化，可有效去除杂质干扰[20−21]。与其他前处理方法相比，传统QuEChERS方法节省了大量时间，但仍需要人员手动完成提取和净化两个步骤。而一步式QuEChERS是一种通过设置仪器参数可在短时间同时完成提取和净化两个步骤的全自动仪器，该方式操作简单，可减少人为参与，提高实验效率和实现重复性[22]，一步式QuEChERS整合管如图1所示。本文建立了一步式QuEChERS结合高效液相色谱串联质谱法检测牛肉中25种磺胺类药物。该方法简单快速、定量准确，可以为牛肉中磺胺类药物残留检测提供技术支撑。

图1 一步式QuEChERS整合管装置Fig.1 One-step QuEChERS centrifuge tube

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛肉样品 购于超市；苯甲酰磺胺、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺脒、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺恶唑、磺胺、磺胺苯吡唑、磺胺吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶25种磺胺类标准物质 纯度≥97%，天津阿尔塔公司；乙腈 色谱纯，美国Fisher公司；乙酸、无水硫酸镁、氯化钠、乙酸钠、无水硫酸钠 分析纯，北京化工厂；乙酸铵 色谱纯，Acros Organics公司；C1850 μm，天津博纳艾杰尔公司；N-丙基乙二胺（PSA） 40~60 μm，天津博纳艾杰尔公司；碳十八键合锆胶（Z-Sep+） 美国Supelco公司；增强型基质去除吸附剂（EMR-Lipid） 美国安捷伦公司；锆珠、双层离心管 北京本立科技有限公司；实验用水Milli-Q超纯水。

Agilent 1290高效液相色谱仪和Agilent 6460三重四极杆质谱仪 配有电喷雾离子源（ESI），美国安捷伦公司；H-30全自动均质仪 中国厦门睿科仪器有限公司；SiO-6512 QuEChERS自动样品制备系统 北京本立科技有限公司；N-EVAP 112型氮吹仪美国Organomation Associates 公司；3-30 K型高速冷冻离心机 德国Sigma 公司；Milli-Q超纯水仪美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取10 mg（精确至0.01 mg）标准品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，于−18 ℃避光保存；根据需要，移取适量储备液，用甲醇稀释，配制所需浓度的标准工作液，于4 ℃避光保存。

1.2.2 样品的前处理 称取2 g（精确至0.01 g）均匀牛肉样品于50 mL双层离心管外管中，加入20 mL的1%乙酸乙腈，10000 r/min均质1 min，加入1.5 g乙酸钠和6颗锆珠，将内管与外管拧紧（内管中含100 mg PSA，100 mg C18，200 mg无水硫酸镁）后放入QuEChERS自动样品制备仪器中，开始自动处理样品。处理结束后取内管中上清液2 mL进行氮吹，氮吹至近干后用2 mL甲醇:水（2:8，v:v）定容，过0.22 μm滤膜，待LC-MS/MS检测。

1.2.3 QuEChERS仪器参数 仪器工作程序设定为第一次振荡转速：1100 r/min；时间：10 min；第一次离心转速：4500 r/min；时间：5 min；第二次振荡转速：1100 r/min；时间：5 min；第二次离心转速：4500 r/min；时间：5 min。

1.2.4 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3 mm×150 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL；流动相：A为0.2%甲酸2 mmol/L 乙酸铵溶液，B为0.2%甲酸甲醇溶液；洗脱梯度：0~0.5 min，5% B，0.5~3 min，5%~15% B；3~10 min，15%~40% B；10~18 min，40%~100% B；18~22 min，100% B；22~22.1 min，100%~5% B；22.1~24 min，5%B；24~26 min，5% B。

1.2.5 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正离子模式；多反应监测（MRM）；毛细管电压；4.0 kV；离子源温度：350 ℃；去溶剂气流：氮气，11 L/min；去溶剂温度：325 ℃；锥孔气流：氮气，8 L/min；碰撞气压：0.4 MPa。其他参数见表1。

表1 25种磺胺类药物的质谱参数Table 1 MS parameters for the 25 sulfonamides

1.3 数据处理

采用Excel和Origin 8.5进行数据处理，结果采用平均值±标准偏差形式表示。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 色谱条件优化 根据文献报道，发现磺胺类药物流动相多使用乙腈[23]和甲醇[4]，本实验参照农业农村部公告第197号-10-2019[24]的洗脱梯度条件，对比了乙腈和甲醇两种有机流动相，发现甲醇作为流动相时可以提高分离效率，同时改善色谱峰形，同时为了兼顾流动相pH，本实验最终选择0.2%甲酸甲醇溶液作为有机流动相。

2.1.2 质谱条件的优化 在最佳色谱条件下，对1 μg/mL的25种磺胺标准溶液进行采集，通过一级质谱扫描获得相应的母离子，并通过优化喷雾电压、喷雾器温度等质谱参数获得最优离子源参数；随后通过子离子扫描选择信号强且稳定的碎片离子，分别确定定性离子及定量离子，进一步优化碎裂电压、碰撞能量等参数，得到目标化合物的MRM质谱参数，具体见表1。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化 磺胺类化合物为弱极性化合物，易于被乙腈或酸化乙腈提取[25]，同时牛肉基质相对复杂，含有大量的蛋白和脂肪等干扰物，乙腈作为提取液时，可使蛋白沉淀[26]。因此，本文对乙腈及酸化乙腈进行优化以选取最优提取条件。结果如图2所示，当乙腈作为提取液时，4种化合物回收率小于70%，而酸化乙腈使所有化合物的回收率均提高10%左右，当提取液为2%的乙酸乙腈时，磺胺的回收率高于120%。因此，本文选择1%乙酸乙腈作为提取液，25种磺胺类化合物回收率均在70%~120%之间。

2.2.2 提取体积及提取次数的优化 为了优化提取效率，对比了1%乙酸乙腈10 mL提取1次，提取2次和20 mL提取1次三种不同的提取次数和体积。由于10 mL提取液用量太少，借助自动QuEChERS设备不能进入内管中，因此，本实验在对比提取液用量时选择使用手动前处理方法。结果见图3，10 mL提取1次时，除磺胺脒外，其余化合物回收率均高于70%，而10 mL提取2次及20 mL提取1次的回收率全部在70%~120%之间。为了减小工作量，本实验选择20 mL提取1次，并与自动QuEChERS前处理方法进行对比，结果发现手动前处理方法与借助自动QuEChERS设备前处理结果无显著差距，各目标化合物回收率均大于70%。为了提高检测效率，本实验最终选择提取液体积为20 mL提取一次，通过自动QuEChERS设备进行提取。

图3 不同提取方式对化合物回收率的影响Fig.3 Effect of different extraction methods on compound recovery

2.3 净化填料的优化

对于牛肉样品，净化的难点在于如何有效去除脂肪干扰物。根据文献报道，增强型去除脂类基质吸附剂EMR-Lipid可去除脂肪[27]，Z-Sep+可用于去除脂肪干扰物[28]，C18可有效去除牛肉中的脂肪和酯类；PSA可去除脂肪酸、有机酸、色素等极性物质。本文对比了500 mg EMR-Lipid、50 mg Z-Sep++200 mg C18+200 mg无水硫酸镁、200 mg PSA+200 mg C18+200 mg无水硫酸镁三组填料的净化效果。从图4可以看出，使用Z-Sep+净化后磺胺噁唑的回收率高于120%外，其余化合物的回收率均在70%~120%之间。使用另外两组填料时，目标化合物的回收率范围均在70%~120%之间，考虑到EMR-Lipid在使用前需要用水活化，增加前处理步骤，最终选择PSA+C18+无水硫酸镁进行净化。

乙腈1%乙酸乙腈2%乙酸乙腈(%)率收回160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40磺胺二甲嘧啶磺胺甲氧哒嗪磺胺甲基嘧啶磺胺邻二甲氧嘧啶磺胺喹噁啉磺胺甲噁唑磺胺对甲氧嘧啶 磺胺吡唑 磺胺苯吡唑磺胺间甲氧嘧啶磺胺间二甲氧嘧啶磺胺吡啶磺胺氯吡嗪磺胺氯哒嗪磺胺二甲异嘧啶磺胺嘧啶磺胺噻唑磺胺恶唑甲氧苄啶 磺胺异噁唑磺胺甲噻二唑 磺胺苯甲酰磺胺磺胺醋酰磺胺脒化合物名称

图4 不同填料对化合物回收率的影响Fig.4 Effect of different adsorbents on compound recovery

由于牛肉中含水量较少，主要去除的干扰物是蛋白质和脂肪，因此本文主要优化C18和PSA用量，对无水硫酸镁只考察使用和不使用时对化合物回收率的影响。对比C18用量为100、200和300 mg时的回收率，结果发现，随着C18用量的增加，部分化合物的回收率会降低，当用量为100 mg时，25种化合物的回收率均在70%~120%之间，详见图5。对比PSA用量发现，当用量为100 mg时，目标化合物的回收率均在70%~120%之间，且回收率明显高于200 mg和300 mg，详见图5；在C18和PSA用量均为100 mg时，对未使用无水硫酸镁和用量200 mg时目标化合物回收率进行了考察，结果发现，使用无水硫酸镁时多种化合物的回收率高于未使用无水硫酸镁时化合物的回收率，以苯甲酰磺胺最为明显。因此，本文选择的最佳净化填料组合为PSA 100 mg、C18100 mg和无水硫酸镁200 mg。

图5 不同填料用量对化合物回收率的影响Fig.5 Effect of different adsorbent dosage on compound recovery

2.4 定容液的选择

本文使用的流动相为0.2%甲酸（含2 mmol/L NH4Ac）水溶液和0.2%甲酸甲醇溶液，且初始流动相为95%水相，因此，定容液的选择也尤其重要。在相同浓度下，对比了不同定容液对目标化合物的影响，当乙腈和甲醇作为定容液时，目标化合物响应均较低，溶剂效应明显，尤其以极性较大的化合物最明显，如磺胺。因此对定容溶液进一步优化，主要增加水的比例，选择甲醇:水（8:2、5:5、4:6:2:8）四种情况，以磺胺为例，当定容液接近初始流动相时，即甲醇:水（2:8）时磺胺响应逐渐提高，且峰形逐渐改善，见图6。

图6 不同定容液对化合物的影响Fig.6 Influence of different constant volume solutions on compounds

2.5 基质效应

以阴性空白样品提取液作为溶剂，配制100 μg/L的混合标准溶液，测定其峰面积为A；以甲醇为溶剂配制100 μg/L的混合标准溶液测定其峰面积为B。基质效应 ME（%）=B/A×100。根据受到基质效应的强弱，将基质效应分为三类：ME%值低于−20%表现为基质抑制效应；ME%值介于−20%和20%之间表现为弱基质效应；ME%值高于20%表现为基质增强效应。结果表明：25种磺胺类化合物均为弱基质效应，见表2。为了定量更准确，本文采用基质匹配标准溶液进行定量。

表2 牛肉中25种磺胺类化合物的基质效应Table 2 Matrix effect for 25 sulfonamides in beef

2.6 方法学评价

2.6.1 线性范围、检出限与定量限 在阴性样品中添加目标化合物，按照1.3步骤测定，以信噪比S/N≥3对应添加水平作为检出限（LOD），信噪比S/N≥10对应的添加水平作为定量限（LOQ），结果见表3。结果显示该方法的检测限在1~3 μg/kg之间，定量限在1~10 μg/kg之间。25种磺胺类化合物在0.1~20 μg/L范围内线性关系良好，相关系数（r）均高于0.990（见表3）。

表3 磺胺类药物线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear range, regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of SAs

2.7 回收率与精密度

为了考察方法的准确度和精密度，对阴性牛肉样品进行添加回收试验。分别选择1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ的混合标准工作液作为添加水平，按前述方法进行前处理，每个添加水平测定5个平行。同时进行空白实验，扣除本底值后计算添加回收率和相对标准偏差。牛肉中25种化合物在1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ添加水平下的回收率分别为70.44%~116.93%、70.14%~91.73%和72.14%~93.62%，相对标准偏差范围分别为0.95%~12.17%、4.07%~13.74%和1.18%~10.74%，结果见表4，表明该方法的准确度和精密度满足准确定量的要求。

表4 准确性和精密度实验结果（n=5）Table 4 Accuracy and precision of the method (n=5)

2.8 实际样品测定

应用本文建立的检测方法对8份市售牛肉样品中25种磺胺类化合物进行了测定，检测结果显示，25种磺胺类化合物在市售牛肉样品中均未检出。

3 结论

本研究建立了自动QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱方法检测牛肉中25种磺胺类合成抗菌药物。对提取液、提取方式、净化条件及定容液等方面进行优化，最终选取1%乙酸乙腈作为提取液，PSA+C18+无水硫酸镁（1+1+2，质量比）净化提取液，HPLC-MS/MS检测，基质匹配外标法定量，该方法具有简单、快速、灵敏度高，降低了基质干扰等优势，可推广用于以牛肉为代表的畜禽肉中25种磺胺类合成抗菌药物的检测。